Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Естественно, что граница обращения описанного эффекта зависит от размера пор геля. Кроме того, скорость миграции денатурированной ДНК сильно увеличивается в присутствии ионов Na+. Последние нейтрализуют заряд фосфатов, взаимное отталкивание которых придает некоторую жесткость и одинарной нити, и хаотический клубок становится компактнее.
Кольцевые ДНК. Двунитевые ДНК форм I, II и III. Вирусные и митохондриальные двунитевые ДНК, а также плазмиды бактерий могут иметь структуру замкнутого двунитевого кольца. Нативное состояние такого кольца — «сверхскрученное». Кольцо в целом сворачивается в «жгут», что сильно увеличивает его компактность (форма I). Если же хотя бы в одной из двух нитей кольца имеется единичный разрыв сахарофосфатной цепи, то «жгут» разворачивается и силами электростатического отталкивания фосфатных групп кольцо расправляется. Компактность молекулы становится меньше, наружные размеры увеличиваются (форма II). Форма I при электрофорезе всегда мигрирует быстрее, чем форма II. Что касается линейной двунитевой молекулы ДНК (форма III), то она может мигрировать быстрее или медленнее, чем сверхскрученное кольцо одинаковой с ней молекулярной массы, в зависимости от среднего размера пор геля. Для крупнопористого геля решающим фактором может оказаться компактность формы I, для мелких пор на первый план выступа-
ет большая гибкость линейной молекулы. Так, для двунитевой репликативной ДНК фага РМ2 в 0,6%-ном геле агарозы скорости миграции трех форм при электрофорезе убывают в порядке I—III—II. Те же ДНК в 1,4%-ном геле мигрируют в последовательности III—I—II. Чем больше напряженность электрического поля, тем при более низкой концентрации геля агарозы проявляется преимущество гибкости формы III. Под воздействием поля, как уже упоминалось, линейная молекула ДНК может относительно легко деформироваться, приспосабливаясь к пространственной конфигурации пор в геле.
Микель и соавторы имели в своем распоряжении более 10 исходных сверхскрученных пл азмидных ДНК с молекулярными масса ми от 3,6 до 55 млн. Облучением в присутствии бромистого этидия из них были получены расправленные кольцевые молекулы с разрывом в одной нити, а с помощью рестриктазы Eco RI — линейные двунитевые молекулы той же молекулярной массы, что и исходные плазмиды [Mickel et al., 1977]. Авторы сопоставляли электрофоретические подвижности всех этих молекул в гелях агарозы различной концентрации. Было обнаружено, что ДНК в виде расправленного кольца (форма II) не только мигрирует медленнее двух остальных форм, но, начиная с молекулярной массы 14—16 млн., вообще не входит даже в 0,6%-ный гель агарозы (рис. 31).
Скорость миграции линейных двунитевых молекул ДНК уменьшается с увеличением их молекулярной массы, но лишь до определенного предела. При молекулярной массе более 5 млн. в 1,6%-ном геле агарозы и более 12 млн. в 0,8%-ном линейные молекулы ДНК мигрируют с одинаковой скоростью независимо от их молекулярной массы (!) и, следовательно, не могут быть разделены электрофорезом. Это происходит именно вследствие гибкости длинных молекул ДНК. Их противоположные концы мигрируют в электрическом поле независимо друг от друга, и вся молекула, извиваясь, проходит через гель одинаково легко (или одинаково трудно) при любой ее длине.
При очень больших значениях молекулярных масс то же становится характерным и для сверхскрученных колец (форма I). В своей сверхскрученности они тоже приобретают своеобразную линейную форму (так сказать, структуру «второго порядка») со всеми вытекающими из ее относительной гибкости последствиями.
Здесь уместно напомнить цитированные в главе 1 данные о различном влиянии эндосмоса в агарозе на скорости миграции трех разных форм двунитевой ДНК (см. рис. 4). В той же работе сообщается о малопонятном влиянии степени загрузки геля агарозы на характер миграции в нем ДНК. По данным авторов, при увеличении количества ДНК, вносимого в один колодец горизонтального геля агарозы, от 0,2 до 5 мкг скорости миграции всех трех форм двунитевой ДНК увеличиваются, а полосы заметно расширяются. При этом загрузку можно было увеличивать за счет одной только формы I, а увеличение скорости и расшире-
М*10~6 М*10~6
Рис. 31. Зависимость электрофоретической подвижности (С/7) двунитевых плазмидных ДНК различного типа в 1%-ном геле агарозы от молекулярной массы (М) и напряженности электрического поля [Mickel et al., 1977]
Типы ДНК: / — сверхскрученная (I); 2 — кольцевая (II); 3 — линейная (III). А — 8 в/см; В — 4 В/см
ние полос происходило в равной мере для всех трех форм [Johnson et al., 1980].
РНК может иметь существенно более невыгодную для миграции в геле вторичную структуру, чем ДНК. Дело в том, что у крупных молекул РНК эта структура представлена многочисленными, торчащими во все стороны «шпильками». Такая молекула не может продвигаться- через поры геля, «извиваясь ужом», ведь «уж», по определению должен быть гладким! Поэтому, например, РНК с молекулярной массой 0,7 млн. даже не входит в 5%-ный ПААГ, в то время как нативная ДНК с молекулярной массой, составляющей несколько десятков миллионов дальтон, может в таком геле мигрировать с вполне заметной скоростью [Flint, Harrington, 1972]. Нечто аналогичное может происходить при частичной денатурации ДНК, когда на прежде «гладкой» двунитевой молекуле образуются вздутия хаотических клубков там, где образовались области разрыва водородных связей между двумя нитями.
