Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Если электрофорез надо вести в условиях, обеспечивающих денатурацию нуклеиновой кислоты, то они могут быть созданы, в частности, полимеризацией геля в 0,02—0,03 М растворе NaOH. Другие варианты — с добавлением в буфер денатурирующих агентов — рассмотрены ниже.
Электропроводность многих названных буферов обусловлена присутствием ионов Na+ в концентрации 0,02—0,04 М, которая может служить для ориентировки при подборе буфера иного состава. Добавим еще, что во все буферы, как правило, вносят ЭДТА до концентрации 1—2 мМ. Это необходимо не только для блокирования активности нуклеаз, но и для предупреждения осаждения нуклеиновых кислот двухвалентными металлами, особенно в щелочной среде.
Рабочие значения напряжения и тока подбирают не только с учетом обеспечения теплоотвода, как для белков, но и с таким расчетом, чтобы напряженность электрического поля в геле не превышала 5 В/см (обычно работают с напряженностями 0,5—
2 В/см). При больших значениях напряженности поля крупные молекулы нуклеиновых кислот могут, деформируясь, «протискиваться» через поры геля независимо от своей массы [Maxwell et al., 1979]. К этому мы еще вернемся ниже.
Выбор характера геля и его пористости
Вторая особенность электрофореза нуклеиновых кислот и их фрагментов — очень широкий диапазон молекулярных масс. Например, при определении нуклеотидной последовательности ДНК или РНК приходится разделять полученные при их гидролизе олигонуклеотиды, содержащие единицы и десятки мономерных звеньев, т. е. молекулы с массами от тысячи до нескольких сотен тысяч дальтон, а это — тот же диапазон, что для белков и пептидов. Естественно, что электрофорез при этом ведут в ПААГ с концентрацией от 5 до 20%, в зависимости от конкретной задачи. С другой стороны, электрофорез можно успешно использовать для разделения плазмид, крупных рестриктов ДНК и даже целых молекул ДНК или РНК вирусов. В этих случаях электрофорез ведут в гелях агарозы.
Для нуклеиновых кислот вирусов и крупных плазмид можно рекомендовать 0,4—0,5%-ные гели агарозы. Для фракционирования рестриктов ДНК, содержащих 5—20 тыс. пар оснований (КВР), т. е. с молекулярной массой до 15 млн. дальтон, ^потре-
бляют 0,7—0,8%-ные гели агарозы. Для более коротких рестрик-тов и гибридных молекул ДНК—РНК, а также для денатуриро-вадной метилртутью РНК используют 1 —1,2%-ные гели. Для двунитевой РНК реовируса длиной 0,5—5 КВР удобно вести электрофорез в 1,5%-ном геле агарозы, а аднонитевые (например, рибосомальные) РНК разделяют в 1,75%-ном геле. Наконец, мРНК и короткие рестрикты ДНК (100—1000 пар оснований) можно фракционировать в 2%-ном геле. Впрочем, для электрофореза РНК чаще используют смешанные гели, содержащие 2—3% ПААГ и 0,4—0,6% агарозы (см. главу 1).
Для фракционирования по размерам очень высокомолекулярных ДНК с молекулярной массой до 110 млн. Север использовал гели агарозы малой концентрации (вплоть до 0,1%). Такие гели являются полужидкими по своей консистенции и могут быть использованы только в варианте горизонтального электрофореза. На стеклянной пластине сначала заливают «рамку» из 1,5%-ной агарозы, которую затем заполняют агарозой малой концентрации [Sewer, 1980]. В то время как скорость миграции двунитевой линейной ДНК в свободной жидкости не зависит от ее молекулярной массы (ввиду постоянства отношения заряда к линейному размеру), электрофорез в гелях агарозы малой концентрации обнаруживает эффект значительного трения ДНК о гель. Даже для ДНК с М = 2 млн. скорость миграции увеличивается в 1,5 раза при переходе от 0,5%-ной агарозы к 0,1%-ной, а для ДНК с М=25 млн. это увеличение оказывается шестикратным, причем в 0,1%-ной агарозе такая ДНК мигрирует еще вдвое медленнее, чем в свободной жидкости.
Исследование показало, что в 0,1%-ном геле агарозы расстояние миграции полос связано с логарифмом молекулярной массы ДНК линейной зависимостью в интервале от 6 до 110 млн. дальтон. Для получения хорошего разделения полос электрофорез в гелях низкой концентрации следует вести при малых значениях напряженности электрического поля. Например, для указанного выше варианта разделения ДНК в 0,1%-ном геле агарозы автор рекомендует ограничиться напряженностью поля 0,34 В/см. Длительность электрофореза при этом составляет 20 ч.
Аналогичное, хотя и менее детальное, исследование возможностей фракционирования высокомолекулярных ДНК в гелях агарозы малой концентрации было проведено ранее [Fangman,
1978]. Здесь молекулярная масса фракционируемой ДНК доходила до 500 млн. (ДНК вируса G из Вас. megatherium, выделенная обработкой вируса горячим саркозилом с последующей очисткой центрифугированием в градиенте плотности раствора CsCl). Подробно описаны предосторожности, необходимые при манипуляциях с такой ДНК во избежание ее разрыва под действием гидродинамических сил.
Влияние вторичной структуры
Третья особенность электрофореза нуклеиновых кислот заключается в сильной зависимости их поведения в геле от вторичной структуры.
Двунитевые и однонитевые структуры. В поведении однони-тевых (РНК, денатурированная ДНК) и двунитевых молекул нуклеиновых кислот многое определяется их размерами. В случае коротких полинуклеотидных цепей нативная двунитевая молекула имеет более жесткую структуру, чем таких же размеров однонитевая. Она труднее изгибается, проходя через пространственную сетку геля. В силу этого, например, относительно короткие двунитевые фрагменты ДНК при близких к нейтральному значениях pH будут отставать при электрофорезе в ПААГ от денатурированных ДНК такой же длины. Это будет иметь место даже для ДНК фага ФХ-174 с молекулярной массой 3,5 млн. дальтон. Однако для более крупных молекул ситуация может измениться на противоположную. Длинная двунитевая цепочка оказывается уже в целом довольно гибкой: она продвигается через поры геля, как бы «извиваясь ужом». Между тем однонитевая цепь той же длины сворачивается в «хаотический клубок» такого размера, что его продвижение в геле оказывается более затрудненным. В этом случае денатурированная ДНК при электрофорезе отстает от нативной. Такую картину, например, можно наблюдать для ДНК фага РМ2 с молекулярной массой 7 млн. [Johnson, Grossman, 1977].
