Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
верхностью геля и пкрнкой или резиной прокладывать слой пористого полиэтилена, Через который вакуум подается и к этой поверхности геля [Joshi, Haenni, 1980].
Недавно было указано ца возможность замены ППО в качестве сцинтиллятора на салицилат натрия [Chamberlain, 1979]. Для него максимум флюоресценции лежит вблизи 410 нм, что вполне приемлемо для экранированной рентгеновской пленки. Главное же преимущество этого реагента — в его водораствори-мости. Автор работы предлагает просто вымачивать гель в 10 объемах 1 М водного раствора салицилата натрия в течение 30 Мин при комнатной температуре, а затем сушить и флюоро-графировать, как обычно. Нагревать гель во время высушивания следует не выше, чем до 80°, во избежание возгонки салициловой кислоты. Раствор салицилата можно хранить в течение 1—2 недель. Потом он коричневеет (по-видимому, окисляется).
После флюорографии для количественных определений радиоактивности полосы из высушенного геля можно вырезать, дать им снова набухнуть в минимальном количестве воды и далее растворять с помощью солюбилизаторов. При оценке эффективности счета в жидком сцинтилляторе можно пользоваться только методом внутренней стандартизации.
Для правильного совмещения изображения на рентгеновской пленке с гелем, без чего из него нельзя вырезать нужные для счета участки, как и при авторадиографии, пользуются реперными отметками по углам пластины геля. Эти отметки делают радиоактивными чернилами. С этой целью можно использовать любые не диффундирующие в геле чернила с примесью плохо растворимого, достаточно активного меченого препарата. Впрочем, забота об отсутствии диффузии чернил относится к случаю авторадиографии влажных гелей, например при регистрации радиоактивного фосфора. Для высушенных гелей это не так существенно.
Комбинацией авторадиографии и флюорографии можно регистрировать в геле двойную метку 3Н и “С (например, сопоставлять составы двух белковых смесей). В белки одной смеси вводят радиоактивную метку по 3Н, в белки второй — по 44С. Обе смеси объединяют и разделяют двумерным электрофорезом. Пластину геля импрегнируют сцинтиллятором, высушивают и регистрируют флюорографией на пленку «Kodak IR-5» сцинтилляцию от обеих белковых смесей (3Н + “С). С негатива делают контактный отпечаток, так что все пятна радиоактивности оказываются белыми. Затем с того же геля на неэкранированную пленку «Kodak NS-5T» при комнатной температуре регистрируют авторадиографией только “С. К свету сцинтилляций эта пленка нечувствительна. Накладывают вторую пленку на позитив с первой. Не закрытые черным белые пятна указывают местонахождение белков, меченных только тритием, т. е. входящих в состав только одной из двух смесей. Затем изотопные метки двух бельевых смесей можно поменять местами [МсСопкеу, 1979].
Авторадиографией и флюорографией мо&но пользоваться не только для пластин, но и для цилиндрических гелей. Для этой цели из цилиндрика геля надо в продольном направлении вырезать плоский слой толщиной 0,5—1,5 u^h. Описано простое приспособление, облегчающее эту операцию [Watts et al., 1977].
Флюорографию нитроцеллюлозах фильтров с перенесенными на их «репликами» белков из геля осуществляют очень просто. Фильтр погружают в 10%-ный раствор ППО в эфире, высушивают и регистрируют сцинтилляцию на рентгеновскую пленку, как это было описано для высушенного геля. Флюорография и авторадиография нитроцёллюлозных фильтров осуществляется лучше, чем в случае гелей, так как белки концентрируются на поверхности фильтров.
ПРЕПАРАТИВНЫИ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ
Электрофорез в ПААГ не получил широкого распространения в качестве препаративного метода фракционирования и очистки белков. Одна из причин этого, по-видимому, состоит в трудности осуществления равномерного теплоотвода из большой массы геля любой конфигурации (цилиндрической, кольцевой или плоской). Неравномерность теплоотвода и возникающие в геле градиенты температуры приводят, как уже отмечалось, к резкому ухудшению качества разделения белков.
Вторая трудность связана с необходимостью создания удобной и Надежной камеры элюции для сбора белков по мере их последовательного выхода из геля. В многочисленных конструкциях, предлагавшихся в начале 70-х годов, такую камеру создавали под вертикально расположенным гелем, отделяя ее от нижнего электродного буфера диализной пленкой. Для сохранения качества разделения, белков камера элюции очень малого объема должна быстро и полно, без застойных зон, промываться элюирующим буфером, а выходящие из геля белки не должны сорбироваться на ее поверхностях, в частности на диализной пленке. Удачного решения этих проблем найдено не было. Столб геля, деформируясь под собственной тяжестью, сползал в камеру, застойные зоны при элюции приводили к смешиванию белков из разных полос, сорбция на пленке оставалась значительной.
Недавно появилось сообщение об еще одной попытке преодолеть указанные трудности. Препаративное фракционирование' белков вели в кольцевом 2,3%-ном ПААГ с ДДС-Na. Диализную мембрану, отделяющую камеру элюции от нижнего электродного резервуара, заменили слоем 10%-ного ПААГ. Во избежание сползания рабочего геля в камеру элюирующий буфер в нее по-давался под гидростатическим давлением, уравновешивающим д^,г^1я, а скорость элюции задавалась перистальтическим на-срсЬ'м,' стоящим на выходе из камеры. Сама камера имела форму незамкнутого кольца. Элюирующий буфер подавался с одного ее конца и выходил с другого. Сообщается о хорошем разделе-
