Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Энгельгард Х. -> "Руководство по капилярному электрофорезу" -> 51

Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.

Энгельгард Х. Руководство по капилярному электрофорезу — Москва, 1996. — 112 c.
Скачать (прямая ссылка): rukovodstvopokapilyaram1996.pdf
Предыдущая << 1 .. 45 46 47 48 49 50 < 51 > 52 53 54 55 56 57 .. 130 >> Следующая

ну геля обычно кладут на подключенную к вакуум-насосу пористую основу и накрйрают листом тонкой резины, которую присасывает вакуумом. Во\избежание прилипания резины к гелю под нее можно положить ^тонкую пленку. Несмотря на высушивание, регистрация р-частйц углерода из глубинных слоев невозможна для гелей с исходной толщиной более 0,4 мм.
Для авторадиографии следует использовать неэкранирован-ную рентгеновскую пленку типа «Kodak No Screen X-Ray Film», например: NS-5T (США) или РТ-1 и РТ-2 (СССР). Фирма LKB (Швеция) рекламирует пленку, пригодную для авторадиографии препаратов, меченных тритием, под названием «LKB-Ultrafilm». Суть дела здесь не в повышении чувствительности, а в отсутствии защитного слоя над-фотографической эмульсией. Это облегчает проникновение в нее «слабых» p-электронов трития, но затрудняет последующую обработку пленки. Чувствительность метода авторадиографии для регистрации “С можно оценить из следующих ориентировочных данных. Радиоактивность порядка 25000 распадов в минуту, равномерно распределенная по площади 1 см2, надежно регистрируется за 24 ч экспозиции.
Для регистрации ^-излучения 1251 удобно применять способ «непрямой» авторадиографии. ^-Излучение регистрируется рентгеновской пленкой, но большая его часть пронизывает ее и теряется, поэтому позади пленки устанавливают так называемый «интенсифицирующий экран», .покрытый твердым сцинтиллятором (CaVO*). Под действием ^-излучения экран флюоресцирует, а свет этой флюоресценции регистрируется пленкой. Разрешение и резкость полос при этом несколько ухудшаются, поскольку экран удален от геля на толщину пленки, а не все у-частицы вылетают из геля перпендикулярно его поверхности, зато выигрыш в чувствительности получается значительный.
Для непрямой авторадиографии следует использовать экранированные рентгеновские пленки, например: «Kodak X-Omat R» и «Kodak RP-50» (США) или РМ-1 (СССР). Интенсифицирующие экраны выпускают, в частности, фирма «Du Pont» (США) под названием «Lightning Plus Intensifying Screen» и химфарм-завод им. Семашко под маркой ЭУ-ВЗ.
Для повышения чувствительности пленки ее иногда предварительно засвечивают до плотности потемнения (после проявления), соответствующей /1В40 = 0,2-^0,3. Объяснение этого странного на первый взгляд феномена можно найти в работе [Laskey, Mills, 1975].
Флюорография
Для регистрации положения в геле белков, меченных тритием, применяют метод флюорографии. Смысл его в том, чтобы ввести сцинтиллятор внутрь геля таким образом, чтобы он находился в непосредственном контакте с радиоактивными белками в полосах. Свечение сцинтиллятора внутри геля легко выходит
из него наружу и регистрируется наложенной на гель рентгеновской пленкой того же типа, который исгшйьзуют при непрямой авторадиографии. По существу говоряутакой подход уже был рассмотрен выше, но тогда не стояла задача сохранения геометрических размеров целой пластины /геля, чего трудно добиться при импрегнировании в гель жидкого сцинтиллятора.
Повсеместное распространение для флюорографии гелей получила процедура, предложенная в 1974 г. Боннером и Ласки. Сначала воду в геле замещают на диметилсульфоксид (ДМСО), вымачивая пластину после фиксации в ней белков в течение 1 ч в двух сменах по 20 объемов ДМСО (по отношению к объему геля). Надо помнить, что ДМСО ядовит и легко проникает через кожу, поэтому работать следует в перчатках. Затем гель переносят на 3 ч в 4 объема 22%-ного (масса/объем) раствора ППО в ДМСО; за это время ППО входит в гель. ДМСО не является сцинтилляционным растворителем, поэтому его необходимо убрать, но так, чтобы ППО остался в геле. Высушить ДМСО не удается, и приходится прибегать к следующему приему. Гель переносят в воду и вымачивают в ней около 1 ч. ППО в воде нерастворим и немедленно выпадает в осадок. Гель становится белым, непрозрачным и заметно твердеет, зато ДМСО снова замещается на воду, которую затем нетрудно высушить, как было описано выше. На фильтровальной бумаге после высушивания остается жесткая белая пленка. Хотя она на вид и непрозрачна, но вспышки сцинтилляций внутри нее (в местах контакта ППО с радиоактивными белками) дают достаточно света, чтобы быть зарегистрированными рентгеновской пленкой. В результате достаточно продолжительного экспонирования на пленке появляется картина расположения радиоактивных полос или пятен в геле [Bonner, Laskey, 1974]. Засвечивание пленки для повышения ее чувствительности производят и в этом случае. Экспонирование пленки следует вести при температуре сухого льда, поскольку при более высокой, пусть даже и отрицательной температуре резко снижается чувствительность метода.
Гели с низким содержанием акриламида, например смешанные тели из 2%-ного ПААГ и агарозы, могут растворяться в ДМСО. Для них в аналогичной процедуре следует заменить ДМСО на метанол (10%-ный раствор ППО в метаноле). Для более концентрированных гелей метанол непригоден — гели в нем сжимаются.
Концентрированные и сильно сшитые гели часто трескаются при сушке обычным способом. Вакуум к гелю обычно подается только с одной стороны через сетку и фильтровальную бумагу. К противоположной стороне геля во время сушки плотно прилегает полиэтиленовая пленка или тонкая резина. Это приводит к тому, что со стороны бумаги гель затвердевает раньше («стекленеет») , а на противоположной его поверхности остается влага, которая может быть отсосана только через трещинки в геле. Во избежание этого дефекта было предложено между свободной по-
Предыдущая << 1 .. 45 46 47 48 49 50 < 51 > 52 53 54 55 56 57 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed