Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Энгельгард Х. -> "Руководство по капилярному электрофорезу" -> 5

Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.

Энгельгард Х. Руководство по капилярному электрофорезу — Москва, 1996. — 112 c.
Скачать (прямая ссылка): rukovodstvopokapilyaram1996.pdf
Предыдущая << 1 .. 2 3 4 < 5 > 6 7 8 9 10 11 .. 130 >> Следующая

Количество ТЕМЕД в объемных процентах можно брать примерно вдвое меньшим, чем персульфата. С учетом различия молекулярных масс и плотности ТЕМЕД это обеспечит их приблизительную эквимолярность. Напомним, что при использовании кислых буферов количество ТЕМЕД следует увеличивать вплоть до 10-кратного по сравнению с персульфатом. Впрочем, нередко вносят избыток ТЕМЕД и в нейтральные буферы. Существенной роли это не играет, если только гель не обнаруживает склонности к растрескиванию при высушивании (для ав: торадйографии). В этом случае содержание ТЕМЕД надо снизить.
Состав буферов, используемых для электрофореза белков и нуклеиновых кислот, не влияет на процесс полимеризации акриламида. Природа, концентрация и pH буфера определяются особенностями самого процесса электрофореза, которые будут рассмотрены ниже. Полимеризации ПААГ не мешает такжщрри-сутствие мочевины (даже.в высоких концентрациях), гуанидин-хлорида, формамида, сахарозы или таких детергентов, как до*
децилсульфат натрия, Тритон Х-100, цетавлон и др. Сахароза даже способствует полимеризации и улучшает механические свойства геля. Разумеется, все эти добавки не должны содержать посторонних примесей. /
Весьма существенно обеспечить чистоту поверхности стеклянных форм для геля. Их тщательно моют лабораторными детергентами и обильно споласкивают водой. Трубки можно мыть щеточкой для курительной трубки. Неплохо дополнительно погрузить пластины или трубки на I—2 ч в хромпик. Иногда их моют горячей азотной кислотой. По хорошо промытой стеклянной поверхности вода должна стекать, не оставляя капель.
ПААГ хорошо прилипает к стеклу даже при малой концентрации акриламида (менее 5%). Это существенно для поддержания геля в устройствах с вертикальным расположением трубок или пластин. Кроме того, хорошее прилипание улучшает теплопередачу от геля к стеклу и уменьшает опасность образования шунтирующей ток пленки жидкости у поверхности стекла. Такой шунт, а иногда и канал, по которому вытекает буфер из верхнего электродного резервуара, может образоваться между боковыми торцами пластины геля и прокладками, определяющими его толщину, в случае загрязнения прокладок или неудачного выбора их материала. Прокладки из тефлона, плексигласа или чистой силиконовой резины не мешают полимеризации геля вблизи их поверхности. Однако некоторые сорта резины с наполнителями, а также смазки, которыми нередко герметизируют прокладки, могут препятствовать полимеризации. Смазку (лучше всего силиконовую) следует наносить тонким валиком из шприца со снятой иглой на таком расстоянии от внутреннего края прокладки, чтобы она не выдавливалась внутрь формы при ее сжатии пружинными зажимами (см. ниже). Для достаточно ровных стекол тефлоновые прокладки можно использовать без смазки.
Гели с высоким содержанием акриламида могут настолько прочно связываться со стеклом, что их последующее извлечение из трубок или снятие стеклянных пластин с геля становится затруднительным. В этом случае можно силиконировать стекло или использовать формы, изготовленные из плексигласа, к которому ПААГ прилипает хуже, чем к стеклу, но при высокой концентрации акриламида — вполне надежно. Полимеризацию геля между тонким стеклом и толстой (для жесткости) пластиной плексигласа удобно проводить для последующего горизонтального электрофореза. После окончания полимеризации плексиглас можно легко снять, а гель на стекле перенести на охлаждающий столик прибора. Полимеризацию ПААГ для горизонтального электрофореза можно вести просто в тонком слое, налитом на строго горизонтальное стекло, если его поместить в кбыгёру, заполненную азотом.
. Особого внимания требует полимеризация «градиентных» ге-Шй с меняющейся по высоте концентрацией акриламида. Тепло-
выделение при полимеризации такого геля будет заметно больше в епЛнижней части, где содержание акриламида выше, а это может привести к тепловой конвекции в жидкости и нарушению градиента.'Во избежание такого явления вместе с концентрацией акриламида по высоте геля варьируют и содержание в нем инициирующих добавок с таким расчетом, чтобы полимеризация начиналась с'верхнего края пластины или трубки и постепенно распространялась вниз.
Выбор концентраций мономеров
Для удобства изложения используются следующие обозначения: Т — процентное отношение суммарной массы обоих мономеров к объему их раствора, С — процентное отношение массы метиленбисакриламида к общей массе обоих мономеров. Величина Т практически варьирует в пределах 3—30%, а С, как правило, составляет 1—5%, что соответствует отношению акри-ламид/Бис в пределах от 99: 1 ло 19: 1. Однако в некоторых особых случаях, рассмотренных ниже, имеет смысл увеличивать С до 20% и более. При указании значений Т и С значок «%» далее будет опущен.
Чем же диктуется выбор значений Г и С? Прежде всего, на этот выбор накладывают ограничения механические и адсорбционные свойства геля. Например, гели с Т^5 и С=1 оказываются слишком мягкими и липкими — их невозможно извлечь из стеклянной формы. Для крупнопористых гелей надо увеличивать степень сшивки (повышать величину С до 3—5), т. е. от-, ношение акриламид/Бис брать в пределах от 35 : 1 до 20 : 1. При этом происходит одновременное повышение прочности геля и ухудшение его способности прилипать к стеклу — гель как бы «замыкается». Мелкопористые гели (Г около 20) при высоком содержании «сшивки» оказываются хрупкими и мутными, поэтому для них величина С не должна превышать 1—2.
Предыдущая << 1 .. 2 3 4 < 5 > 6 7 8 9 10 11 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed