Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Нитроцеллюлозные мембранные фильтры обладают способностью сорбировать щелочные белки. Этим можно воспользоваться для получения «реплики». Фильтр накладывают на поверхность геля, и выходящие из него за счет диффузии белки тут же сорбируются и располагаются на нитроцеллюлозе точно такими же полосами, как и в геле. Далее уже на фильтре можно проводить идентификацию белков, например гибридизацией их с меченной заР ДНК [Bowen et al., 1980]. Простейшее устройство для этой цели, предложенное авторами цитируемой работы,
показано схематически на рис. 29. К пластине геля с двух сторон металлическими сетками через пропитанные буфером поролоновые прокладки прижимают нитроцеллюлозные фильтры (18Х Х18 см) рабочей поверхностью к гелю. Фильтры предварительно смачивают буфером, чтобы в них не оставалось окклюдированного воздуха. Для этого следует дать им некоторое время поплавать на поверхности буфера, а потом уже погрузить в него.
Если электрофорез шел в присутствии ДДС-Na, белки пред-
Рис. 29. Устройство для диффузии белков из геля на нит-роделлюлозный фильтр [Bowen et al., 1980]
} — сетка из нержавеющей стали;
2 — поролон; 3 — нитроцеллюлоз-ный фильтр; 4 — ПААГ
варительно освобождают от него, вымачивая гель в 0,01 М растворе Трис-HCl (pH 7), содержащем 0,05 М NaCl, 2 мМ ЭДТА и 4 М мочевину, в течение 3 ч с перемешиванием. Для более полного освобождения от ДДС-Na в этот раствор можно сначала ввести 1% Тритона Х-100, а потом отмывать тем же буфером без детергента. Собранную, как описано выше, многослойную систему погружают в 2 л того же буфера, но без мочевины. Диффузия идет при комнатной температуре в течение 36—48 ч с одной сменой буфера.
Белки на фильтре можно окрасить, а радиоактивные — обнаружить флюорографией (см. ниже). Для этого высушенный фильтр ненадолго замачивают в 10%-ном растворе ППО в эфире и накладывают на него рентгеновскую пленку. Флюорография или авторадиография с фильтра идет значительно лучше, чем с геля, так как белки сорбируются на поверхности мембранного фильтра.
Выход белков из геля на фильтр можно значительно ускорить, использовав электрофоретическую элюцию белков из пластины геля в поперечном направлении, подобно тому, как это было описано для электрофоретической отмывки красителя [Towbin et al., 1979]. Для этого собирают такую же систему, как в предыдущем варианте, с тем лишь отличием, что нитроцеллю-лозный фильтр («Millipore НА») накладывают на гель только с одной стороны — той, куда будут мигрировать белки под действием электрического поля. Весь «сэндвич» помещают в прибор для электрофоретической отмывки геля и подбирают напряжение так, чтобы напряженность поля в геле составляла около 6 В/см. Если электрофорез белков вели в отсутствие ДДС-Na (например, с мочевиной), то предварительное вымачивание геля и всех компонентов системы, а также саму элюцию можно вести в 0,7%-ной уксусной кислоте. За 1 ч белки полностью выходят из геля в направлении катода и прочно сорбируются на нитроцел-
Hlillll!lllliliMlllllillll-<-
^ЛУЛУ/У/У/УУ/*-.
IJ
ГПТТТТГ)
люлозе. Однако не следует допускать перегрузки фильтра: его сорбционная емкость составляет примерно 0,15 мкг белка на
1 мм1 поверхности. Для проверки можно вслед за первым положить второй листок нитроцеллюлозы — на нем не должно быть белка.
Если разделение белков вели в комплексе с ДДС-Na, то и элюировать их можно в этом комплексе. В таком случае следует использовать буфер того же типа, каКой используют для верхнего электродного резервуара ступенчатой системы электрофореза по Лэммли (0,192 М глицин, 25 мМ Трис, 20%-ный метанол; pH 8,3). Направление миграции белков — к аноду. Выход белка при этом получается неполным.
Перешедшие на фильтр белки Таубин и соавторы идентифицировали иммунологически. Подробное рассмотрение метода выходит за рамки этой книги, поэтому ниже он описан лишь вкратце. Фильтр вымачивали в 3%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина для насыщения оставшихся свободными центров сорбции, затем инкубировали с антисывороткой к интересующему белку, промывали и инкубировали с «индикаторными» антителами к иммуноглобулинам первой сыворотки, конъюгированными с флюоресцентным красителем или меченными радиоактивно. Перенос белков из геля на нитроцеллюлозный фильтр существенно облегчает их иммунологическую идентификацию, так как крупные молекулы ‘у-глобулииов плохо диффундируют в гель, тогда как фильтр сорбирует белки на своей поверхности и они легко доступны для антител.
Описанный прием идентификации можно использовать во всех случаях, когда белок способен образовывать специфические комплексы (гормон—рецептор, рецептор—цАМФ, белок—нуклеиновая кислота и др.), — конечно, при условии, что его активные группы остаются открытыми при сорбции на нитроцеллюлозу. Впрочем, последнее требование может относиться лишь к небольшой доле молекул белка данного типа, достаточной для идентификации всей полосы.
Нитроцеллюлоза сорбирует только щелочные белки. Распространение этого метода на любые белки связано с использованием так называемой «диазобумаги», на которой предварительно закреплены афинные сорбенты, например: антитела или антигены [Erlich et al., 1979]. Диазобумага была разработана и нашла себе применение главным образом для гибридизации нуклеиновых кислот [Alwine et al., 1977], поэтому здесь нет места для описания ее особенностей. Отметим только способ переноса белков из ПААГ на диазобумагу. После электрофореза белков в системе Лэммли ДДС-Na вымывают из геля 0,15 М. Na-фосфэтным буфером (pH 7,4) с 0,15 М NaCl и 0,5% Тритона Х-100 при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем гель кладут на стопку фильтровальной бумаги в кювету, заполненную тем же буфером, накрывают диазобумагой, а ее — несколькими слоями сухой фильтровальной бумаги. Всю пачку прижимают через стеклян-
