Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Недавно [Higgins, Dahmus, 1979] было предложено после окончания электрофореза вымачивать гель в течение 1 ч при 25° в 10—12 объемах 4 М раствора ацетата натрия. Свободный ДДС-Na, который в концентрации 0,1% присутствует в геле, выпадает в осадок — гель становится белым и непрозрачным. Белки, связанные с ДДС-Na, при этом не осаждаются. Их прозрачные полосы хорощо видны на темном фоне при освещении геля сбоку и снизу. Чувствительность метода — 0,1 мкг белка на 1 мм* площади пятна или полосы.
Простейший прием э/иоции состоит в извлечении белка из полоски или кусочка геля за счет диффузии в течение длительного времени при 37—40°. Этот прием пригоден как для свободных белков, так и для их комплексов с ДДС-Na. С целью облегчения диффузии белков из геля последний измельчают, например растирают в маленьком стеклянном гомогенизаторе. Во время элю-ции суспензию измельченного геля встряхивают. В элюирующий буфер, как правило, вводят ДДС-Na даже в тех случаях, когда электрофорез белка проводили без него. Это делают для облегчения растворения белков. После окончания экстракции гель ' удаляют центрифугированием. От ДДС-Na и красителя белок можно освободить осаждением и промывкой сначала смесью ацетона с 0,1 М НС1 (6:1), а затем чистым ацетоном. Осажденный ацетоном белок высушивают или лиофилизируют. Брэй и Браунли [Bray, Brownlee, 1973] элюировали таким образом белок в 0,05 М Na-фосфэтный буфер (pH 7,5) с 0,1% ДДС-Na и 1 мМ ФМСФ 1 при 37° в течение ночи при встряхивании. Белок в комплексе с ДДС-Na осаждали (за счет ДДС-Na) добавлением КС1 до 0,2 М и выдерживанием при 0°. Дрешер и Ли гомогенизировали кусочки геля в малом объеме 1%-ного раствора ДДС-Na и элюировали белки в течение ночи при 40°. Такая концентрация ДДС-Na оказалась необходимой для растворения белков, осажденных в геле в ходе их фиксации кислотой и окрашивания [Drescher, Lee, 1978]. В другой работе [Sreekrishna et al., 1980] белки, предназначенные для последующего аминокислотного анализа, элюировали из ПААГ гомогенизацией в 0,05 М растворе бикарбоната аммония с 0,05% ДДС-Na и инкубацией в течение 10 ч при 37°. Бикарбонат аммония удаляли повторной лиофилизацией. От ДДС-Na избавлялись, осаждая белок добавлением 9 объемов подкисленного ацетона после растворения лиофилизированного препарата в воде до концентрации 1% по ДДС-Na.
Иногда для улучшения растворения осажденного в геле белка экстракцию ведут в 1%-ном ДДС-Na с 6 М мочевиной [Buis-son et al., 1976]. Щелочные негистоновые белки хроматина можно экстрагировать 66%-ной уксусной кислотой на холоду [Rab-bani et al., 1980]. Белки рибосом после двумерного электрофореза и окраски СВВ R-250 можно также элюировать 66%-ной уксусной кислотой. Краситель легко затем удалить на микроколонке ДЭАЭ-целлюлозы прямо в той же кислоте. Анионный по своей природе краситель десорбируется с белка и полностью задерживается на анионообменййке, а щелочные рибосомальные белки с ним не связываются [Bernabeu et al., 1980].
Описан способ экстракции белков в комплексе с ДДС-Na 60%-ной муравьиной кислотой [Gibson, Сгасу, 1979], которую
1 Фенилметилсульфонилфторид — ингибитор протеаз.
затем упаривают, а сухой остаток суспендируют в 6 н. НС1. Белок при этом растворяется, а ДДС-Na остается в осадке. Его удаляют центрифугированием, а краситель из раствора белка в кислоте извлекают троекратной экстракцией октанолом. Соляную кислоту удаляют высушиванием в струе азота, разбавив предварительно препарат водой.
Возможен и другой подход. Сначала ДДС-Na и краситель экстрагируют из ПААГ без растворения осажденного в полосах белка. Этого добиваются пятикратной гомогенизацией геля в растворе, содержащем 10% ТХУ и 30% этанола. Гель каждый раз осаждают центрифугированием. Из очищенного таким образом геля белки экстрагируют 0,1 М NaOH в течение 2 ч при 37° при встряхивании [Djondjurov, Holtzer, 1979]. Для малых концентраций белков в полосах этот метод не подходит, так как часть белков вымывается при обработке геля ТХУ.
Нефиксированные белки удобно извлекать из геля возобновлением электрофореза до выхода белка из геля. Содержащую нужный белок полосу (или пятно) в геле локализуют сопоставлением с окрашенными белками в параллельном контрольном треке на пластине, который предварительно отрезают, или в контрольной трубке. Можно фиксировать положение полос и с помощью данзилированных маркеров (см. выше). Вырезанный из геля участок помещают в трубку на небольшую «пробку» из крупнопористого ПААГ или агарозы и заливают буфером, а на нижний конец трубки надевают заполненный буфером диализный мешочек. Затем возобновляют электрофорез и ведут его до тех пор, пока белок не выйдет из трубки в мешочек [Weliky et al., 1975]. Особенно удобно следить за выходом белка при наличии данзилированных маркеров. Если находящийся в диализном мешочке буфер содержит в избытке неионный детергент (2% NP-40) и 8 М мочевину, то ДДС-Na практически полностью вытесняется из связи с белком и уходит через мембрану к аноду [Tuszynski et al., 1977].
Описан вариант, при котором белок электрофоретически элюируют в трубку большего диаметра, где на пробке из ПААГ лежит слой оксиапатита, уравновешенного 0,1 М Na-фосфатным буфером (pH 7,2) с 0,1% ДДС-Na. Несмотря на действие электрического поля, белок собируется на оксиапатите, откуда его затем, разобрав всю систему, можно элюировать 0,5 М фосфатным буфером [Ziola, Seraba, 1976].
