Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
В качестве примера можно назвать часто употребляющийся препарат «Methyl thiazolyl blue» (МТТ) или еще более сложное соединение «Nitro blue tetrazolium» (NBT). В окисленном виде
обе эти соли бесцветны. При восстановлении первая дает синепурпурную, а вторая — иссиня-черную окраску. Реакция восстановления красителей ускоряется в присутствии промежуточного переносчика электронов «Phenazine methosulfate» (PMS) или нового, более стойкого реагента, выпускаемого для этой цели фирмой «Boehringer» под названием «Meldolablue» [Turner, Hopkinson, 1979].
/
>N—NH <
N==Ny
Тетразолиевая соль
Формаэан
OCH3
Н3СО
NBT
Для обнаружения в геле протеолитических ферментов предложен ряд нетривиальных методов. Например, после электрофореза гель вымачивают в течение 2 ч при 37° в 8%-ном растворе цитохрома с в буфере с pH 8,5, содержащем 8 М мочевину и 1,7 мМ СаС12. Затем белок фиксируют в 12,5%-ной ТХУ. Диффундируя в гель, цитохром с окрашивает его в коричневый цвет по всему объему. Полосы протеаз, разрушающих цитохром су остаются прозрачными и хорошо видны на коричневом фоне [Ward, 1976]. Суть другого подхода заключается в том, что на гель накладывают обработанную закрепителем в темноте (для удаления серебра) и вымоченную в буфере фотопленку. После трехчасовой выдержки при 35° во влажной камере на фотопленке можно обнаружить следы диффузии в нее протеаз, разрушающих слой желатины [Burger, Schroeder, 1976].
Для обнаружения нуклеаз при полимеризации геля в него вносят ДНК (Ю мкг/мл) или РНК (25 мкг/мл). Если нуклеазы для своего действия нуждаются в ионах Mg2+, Са2+ или Zn2+, то в их растворе ПААГ вымачивают после окончания электрофореза. Далее следует окрашивание геля красителем для нуклеиновых кислот — бромистым этидием (см. главу 4). Окрашивается весь гель, за исключением полос, содержащих нуклеазы, где нуклеиновая кислота разрушена. Можно вести разделение нуклеаз и в присутствии ДДС-Na, блокирующего их действие во время электрофореза. Перед обработкой бромистым этидием ДДС-Na из геля вымывают.
Заполимеризовав в ПААГ денатурированную ДНК, можно выявить нуклеазы, специфичные для однонитевых ДНК. Можно также исследовать оптимизацию условий, необходимых для активности нуклеаз, варьируя состав буфера геля, или опробовать различные ингибиторы нуклеазной активности. С помощью кольцевых ДНК удается отличить эндонуклеазы от экзонуклеаз. Электрофорезу можно подвергнуть лизаты бактерий для выяснения содержания в них нуклеаз [Rosenthal, Lacks, 1977]. Окрашивание бромистым этидием в описанных опытах можно заменить авторадиографией (см. ниже), если в гель заполимеризо-вать меченную 32Р нуклеиновую кислоту или синтетический полинуклеотид [Iborra et al., 1979].
Выше указывалось, что для локализации ферментов по их активности электрофорез желательно проводить в условиях, исключающих возможность денатурации. Однако в недавней работе [Lacks, Springhorn, 1980] было показано, что очистку целого ряда ферментов (ДНКазы I, некоторых протеаз, амилазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы) можно производить электрофорезом в ПААГ с ДДС-Na после соответствующей обработки их детергентом при повышенной температуре. Денатурация оказывается обратимой. По окончании электрофореза ДДС-Na отмывают и одновременно снимают с белка встряхиванием геля в течение 1—2 ч в 0,04 М Трис-буфере, pH 7,6. Ферментативная активность в ряде случаев восстанавливается.
По данным Хагера и Буржесс, при снятии ДДС-Na с фермента имеет смысл денатурировать его кратковременной обработкой 6 М гуанидинхлоридом с последующей ренатурацей при разбавлении. Возможно, что при этом восстанавливается нативная конфигурация белка, нарушенная при первоначальной обработке ДДС-Na [Hager, Burgess, 1980]. Для ферментов, содержащих несколько полипептидных цепей (химотрипсин), предварительную обработку p-меркаптоэтанолом, разумеется, следует исключить. Впрочем,, то же самое относится и к одноцепочечному трипсину. По-видимому, разрыв внутрицепочечных S—S-связей в нем приводит к необратимой денатурации. Ферменты, состоящие более чем из двух субъединиц, не ренатурируют.
В заключение отметим, что гликопротеиды после электрофореза в ПААГ можно локализовать, вымачивая гель в растворе конканавалина А, конъюгированного с флюоресцентной меткой, например с флюоресцеинизотиоцианатом [Furlan et al., 1979], или радиоактивно меченного введением 125I [Horst et al., 1980].
Локализация белковых полос осаждением ДДС-Na
Не очень чувствительные, но быстрые и простые методы позволяют обнаружить полосы белка после электрофореза в присутствии ДДС-Na по осаждению этого детергента. Наиболее простой способ состоит в охлаждении геля до температуры 0—4°. При боковом освещении на фоне черного"бархата непрозрачные белковые полосы и пятна хорошо видны среди почти прозрачного геля. По-видимому, комплексы белок—ДДС-Na служат ядрами конденсации большого количества мицелл ДДС-Na, растворимость которого очень сильно зависит от температуры. При отогревании геля полосы и пятна исчезают. Нижний порог чувствительности этого метода — 0^ мкг белка на 1 мм* площади пятна [Wallace et al., 1974]. Попутно отметим недавно описанный, аналогичный способ обнаружения белков в ПААГ, содержащем 8 М мочевину. Гель выдерживают 5—10 мин при —70°. В местах расположения белковых зон за счет связывания части свободной воды белками мочевина кристаллизуется, давая непрозрачные полосы. Остальной гель при этом остается прозрачным [Bachrach, 1981].
