Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Энгельгард Х. -> "Руководство по капилярному электрофорезу" -> 43

Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.

Энгельгард Х. Руководство по капилярному электрофорезу — Москва, 1996. — 112 c.
Скачать (прямая ссылка): rukovodstvopokapilyaram1996.pdf
Предыдущая << 1 .. 37 38 39 40 41 42 < 43 > 44 45 46 47 48 49 .. 130 >> Следующая

Недавно был предложен принципиально новый способ окраски белков после электрофореза в ПААГ, обеспечивающий, по утверждению авторов, на два порядка более высокую чувствительность, чем СВВ R-250 [Merril et al., 1979]. Белки окрашивают ионами серебра в присутствии небольшой добавки ионов меди. Эти ионы вносят в составе нитратов серебра и меди, растворенных в воде с добавлением пиридина и этанола. Гель предварительно обрабатывают формальдегидом. После первой обработки этими ионами гель еще раз споласкивают довольно концентрированным (11%) щелочным раствором нитрата серебра и, наконец, восстанавливают серебро обработкой смесью формальдегида и лимонной кислоты в 10%-ном этаноле. Механизм окрашивания неясен. По-видимому, он сходен с восстановлением серебра'в фотографическом процессе, так как «передержанный» гель можно ослабить обычным ослабителем для фотографии.
Несмотря на свою огромную чувствительность, предложенный способ достаточно сложен и связан с расходом дорогостоящего нитрата серебра, поэтому в середине 1980 г. другая группа авторов опубликовала упрощенную методику высокочувствительной окраски белков серебром, дающую, по-видймому, такие же результаты [Oakley et al., 1980]. Ввиду перспективности этого метода цитируем его подробно.
Все растворы готовят на бидистилляте, а работу ведут в перчатках. Приведенный ниже режим обработки соответствует пластинам размером 140Х ХИ0Х0,8 мм; для более толстых гелей продолжительность обработки на каждом этапе надо увеличить. При всех процедурах, кроме одной, используют осторожное перемешивание растворов на ротационной мешалке («New Brunswick gyrotory shaker», модель 2) со скоростью 40 об/мин. Ниже описаны соответствующие процедуры.
Гель вымачивают в течение 30 мин в 10%-ном водном растворе глутаро-вого альдегида, споласкивают в течение 10 мин в 0,5—1 л воды с двумя сменами и оставляют для набухания в воде не менее чем на 2 ч. Затем воду сливают и заливают гель свежеприготовленным раствором аммиачного серебра. Для получения 100 мл этого раствора добавляют 1,4 мл свежего концентрированного раствора аммиака к 21 мл 0,36%-ного раствора NaOH, а затем с энергичным перемешиванием медленно прибавляют 4 мл 19,4%-ного раствора азотнокислого серебра (20 г AgNOs+lOO мл воды). При а*ом может временно образоваться коричневый осадок. После его растворения добавляют воду до объема 100 мл. Для создания хорошей, ровной окраски и во избежание прилипания геля ко дну надо, чтобы он свободно плавал в ванночке размером 20X20 см со 150 мл раствора аммиачного серебра. Скорость перемешивания в это время следует увеличить до 75 об/мин. Окрашивание должно длиться не более 15 мин, чтобы серебро не успело осесть на поверхности геля. Так как раствор аммиачного серебра при высыхании может взрываться, после его использования серебро осаждают в виде AgCl подкислением НС1. Гель вынимают из раствора и промывают водой в течение 2 мин. Чтобы он не прилип к кювете, здесь и на следующем этапе следует не сливать жидкость, а переносить его из кюветы в кювету. Затем гель переносят в свежеприготовленный раствор, содержащий 0,005% лимонной кислоты и 0,019% формальдегида (разбавлен из продажного 38%-ного формальдегида в 10'%-ном метаноле); при этом и проступают полосы белков. Гель вынимают, когда фон только начинает темнеть, и промывают водой в течение часа с тремя сменами при перемешивании. Если концентрация ПААГ превышает 10%, то фон может оказаться темным. Он уменьшается в случае предварительной фиксации белков в 10%-ной уксусной кислоте с 50% метанола в течение 30 мин и последующей промывки геля в 7%-ной уксусной кислоте с 5% метанола в течение ночи.
Минимальная концентрация белка в полосе, которую можно обнаружить, составляет примерно 10~4 мкг/мм2. По приведенным в работе фотографиям создается впечатление, что чувствительность метода столь же высока, как и первоначальной методики Меррила и- соавторов, но четкость линий немного хуже. В этом случае также возможно ослабление с помощью фотоослабителей.
Хотя в рассмотренной работе об этом и не говорится, Меррил и соавторы указывают, что после окрашивания серебром гели ' становятся хрупкими. Для высушивания их рекомендуется предварительно подвергнуть следующей обработке: вымочить в течение 15 мин в 30%-ном водном растворе тиосульфата натрия, промыть 4 раза по 15 мин в воде и, наконец, вымочить в смеси метанол— вода-глицерин (70:27 : 3) в течение 5 мин.
В начале 1981 г. Меррил и соавторы предложили еще одну методику окрашивания белков в геле серебром. В отличие от их первого метода, где был использован гистологический подход, в данном случае восстановление серебра происходит фотохимическим путем.
После двумерного разделения белков в ПААГ по О'Фаррелл у их фиксируют и одновременно вымывают ДДС-Na сначала раствором, содержащим 12% СНзСООН и 50% метанола (10 мин), потом дважды по 5 мин —5%-ной СНзСООН с 10% этанола. Далее для улучшения равномерности окраски гель вымачивают 5 мин в 0,5%-ном растворе железосинеродистого калия (красной кровяной соли), После трехкратного ополаскивания в воде гель заливают раствором, содержащим 0,2 г нитрата серебра, 0,2 г нитрата аммония, 0,5 мл 37%-ного формальдегида и 0,06 мг бензотриазола (антивуалирующего средства для фотографии) в 100 мл воды. Гель в растворе освещают вольфрамовой лампой накаливания мощностью 1500 Вт в течение 20 мин. Затем раствор сливают и гель, не споласкивая, заливают 200 мл 3%-ного раствора Na2C03, содержащего 0,1 мл формальдегида и 0,12 мг бензотриазола. Окраска появляется уже через 1 мин. Не прекращая освещения, раствор сменяют 2—3 раза до достижения желаемой интенсивности окраски белков. Процесс окрашивания прерывают погружением геля на 5 мин в 1%-ны.й раствор СН3СООН, а затем промывают его водой.
Предыдущая << 1 .. 37 38 39 40 41 42 < 43 > 44 45 46 47 48 49 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed