Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Для окрашивания гистонов после электрофореза иногда используют краситель «Fast green FCF» [McMaster-Kaye, Kaye, 1974]. Его можно использовать и для других белков. Он менее чувствителен, чем СВВ, но более надежен для количественных оценок содержания белка в полосах путем денситометрирования, так как при отмывке геля СВВ в большей степени, чем «Fast green», вымывается из белковых полос, причем иной раз неодинаково для различных белков [Bertolini et al., 1976].
Следует отметить, что в случае плотных белковых полос при недостаточной продолжительности окрашивания можно столкнуться с артефактом — возникновением «двойной полосы». На самом же деле это одна полоса, интенсивно окрашенная с двух своих торцевых поверхностей.
Во всех описанных способах белки перед окрашиванием или в его процессе фиксируют осаждением кислотой и спиртом. Однако некоторые основные белки (например, рибонуклеаза и протамин), а также низкомолекулярные пептиды и гормоны при такой обработке не осаждаются, а, наоборот, растворяются и вымываются из геля. Недавно был предложен принципиально' иной подход к фиксации белков и пептидов в геле после электрофореза. Гель в течение 1 ч вымачивают в 5%-ном растворе формальдегида в 25%-ном этаноле с добавлением СВВ R-250 до 0,11%. В этих условиях формальдегид ковалентно сшивает пептиды с матрицей геля за счет образования метиленовых мостиков между аминогруппами аминокислот и первичными аминами ПААГ. На приведенных в работе фотографиях можно видеть разительный эффект обнаружения щелочных и низкомолекулярных белков: гели, кажущиеся пустыми при обычном окрашивании, на самом деле содержат множество белковых полос. Гели с ДДС-Na красят более продолжительное время (до 3 ч) в 3,5%-ном рас-
творе формальдегида, что обеспечивает вытеснение ДДС-Ыа красителем. Отмывку гелей ведут в течение ночи в 3,5%-ном растворе формальдегида в 25%-ном этаноле [Steck et al., 1980].
Другие красители и методы окрашивания
Определенные затруднения возникают при окраске кислых фосфопротеидов, например фосфитина. Наличие отрицательно заряженных остатков фосфорной кислоты мешает окрашиванию анионными красителями. Конечно, можно использовать такие положительно заряженные (катионные) красители, как толуи-диновый синий или акридиновый оранжевый (см. ниже), но они дают высокий уровень фона, так как матрица ПААГ всегда несет на себе некоторое количество отрицательно заряженных остатков акриловой кислоты.
Есть возможность пойти другим путем. Известна высокая степень сродства фосфопротеидов к трехвалентным металлам, поэтому можно использовать ионы А13+ для блокирования зарядов фосфатов. Это позволит успешно вести окрашивание белков кислым красителем. Так, для фосфопротеидов была рекомендована следующая смесь: 0,05% СВВ R-250+0,1 М A1(NOS)S+10% уксусной кислоты + 25% изопропанола+1% Тритона Х-100. Отмывают гель, как обычно, в 7%-ной уксусной кислоте [Hege-nauer et al., 1977].
Гликопротеиды, белки, липиды и даже нуклеиновые кислоты можно окрасить одновременно красителем с выразительным фирменным названием «Stains-all», формула которого представлена ниже.
0,1%-ный маточный раствор этого, красителя в формамиде можно хранить при 4° в темной бутыли в течение месяца. Его рабочая концентрация — 0,0012% в 0,01 М Трис-НС1 (pH 8,5) с 5% формамида и 25% изопропанола. Окрашивать гель следует в темноте, в течение ночи. Можно затем отмывать гель в воде, но делать это не обязательно, так как на свету находящийся в геле свободный краситель быстро выцветает, в то время как связанный с белком оказывается значительно более стойким. Замечательно, что разные по своей природе биополимеры окрашиваются при этом в различные цвета: гликопротеиды — в синий, белки — в красный, липиды — в желто-оранжевый, ДНК — в синий, а РНК—в голубовато-пурпурный. Однако по. чувствительности этот универсальный краситель заметно уступает специализированным. Кроме того, он обесцвечивается при контакте с ДДС-Na,
который из-pa этого приходится отмывать после электрофореза, вымачивая гель в течение 18—36 ч в 25%-ном растворе изопропанола [King, Morrison, 1976].
Если примириться с некоторой диффузией полос во время окрашивания и не осаждать белки, то их можно красить в водных буферах кислыми или щелочными красителями (в зависимости от заряда белка). Связь между красителем и белком в этих случаях осуществляется в основном за счет сил кулоновского взаимодействия. В области нейтральных pH такие кислые красители, как СВВ, бромфеноловый синий и «Fast green», заряжены отрицательно. Их изоэлектрическая точка лежит ниже pH 3,5. Щелочные красители (метиленовый синий, толуидиновый синий и пиронин) в нейтральных буферах несут положительный заряд (р/>9,5). Таким образом, кислые белки в мягких условиях можно красить щелочными красителями, а щелочные — кислыми. Красители растворяют в воде до концентрации 0,02% и нейтрализуют раствор добавлением 0,2 М фосфатного буфера (pH 7) до концентрации 5 мМ. Гель после электрофореза для удаления избытка рабочего буфера вымачивают в воде в течение 5 мин, затем окрашивают 10 мин при комнатной температуре. Отмыть фон можно в течение часа в деионизованной воде или смеси метанол—вода (1:2), что стабилизирует окраску. Окрашенные гели хранят в разбавленных водных растворах красителей во избежание их десорбции. В воду добавляют в качестве антисептика азид натрия до концентрации 0,01% [Ruchel et al., 1978].
