Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
или ТХУ, поэтому преимущественный заряд любого белка оказывается положительным за счет остатков лизина, аргинина и гистидина, так что для белков используются преимущественно кислые красители, несущие остатки сульфокислоты. Они сохраняют свой отрицательный заряд и при низких значениях pH.
В прошлом десятилетии широко использовали «амидо-шварц» — краситель с фирменным названием «Amido Black 10В» (сейчас его выпускают под названием «Naphthalene Black 12В»), Его растворяли до концентрации 1% в 7%-ном растворе уксусной кислоты. В настоящее время его вытеснил другой краситель— кумасси ярко-голубой («Coomassie brilliant blue», сокращенно СВВ). Этот краситель дает лучшую чувствительность и линейную зависимость интенсивности окраски от концентрации $елка~в более широком ее диапазоне. Краситель выпускают в двух модификациях: R-250 и G-250. Здесь для ориентировки приведена структурная формула второго из них. Структура СВВ R-250 отличается только отсутствием двух метальных групп. Фирма BDH сейчас выпускает эти красители под названиями «PAGE blue 83» и «PAGE blue G-90» соответственно.
Обилие ароматических колец в структуре красителей типа СВВ делает их плохо растворимыми не только в воде, но и в разбавленной уксусной кислоте. Для улучшения растворимости к кислоте часто добавляют метанол. Обычно используют водные растворы, содержащие 9—10% уксусной кислоты и 40—45% метанола (по объему), однако рабочая концентрация С’ВВ R-2^0 в этой смеси составляет 0,1—0,25%, реже 0,5%. Иногда СВВ R-250 растворяют в 25%50%-ной ТХУ или в смеси, содержащей 10% ТХУ и 25% изопропанола (остальное — вода). Возможны и другие варианты, не меняющие существа дела: краситель должен полностью раствориться в кислом растворителе, осаждаю-щем__белок. Не растворившиеся примеси следует отфильтровать. Их наличие не говорит о плохом выборе растворителя, так как
препараты красителя, изготавливаемые для промышленных целей, редко бывают чистыми.
Продолжительность окрашивания зависит от толщины и пористости геля и может варьировать от 2—3 до 12 ч. Для ускорения процесса можно окрашивать гель при 37°, а ванночку с рас-створом красителя покачивать. Отмывку от не связавшегося с белком красителя ведут, как описано выше, например вымачивая гель в 7%-ной уксусной кислоте или в смеси, содержащей 7,5% уксусной кислоты и 5% метанола. В этих условиях растворимость красителя достаточна для вымывания его свободных молекул, а десорбция его с белка незначительна. Если электрофорез вели в присутствии высокой концентрации мочевины, то лучше отмывать смесью, содержащей 7,5% уксусной кислоты и 20% метанола.
Гель из трубки отмывают в пробирке, пластину геля — в ванночке. При окрашивании соотношение объемов жидкости и геля должно составлять примерно 3:1, при отмывке — 5:1 или даже 10: 1 с двумя-тремя стенами растворителя. Если в растворитель добавлена ионообменная смола, то его менять не нужно. Отмывку можно вести поперечным электрофорезом, как подробно описано выше.
Окрашенный гель из трубки можно сканировать в специальном приборе или с помощью приставки, которой комплектуются сейчас многие продажные спектрофотометры. Не следует, впрочем, слишком дадягяться ня соотношение размеров пиков такой электрофореграммы при оценке количественного соотношения
ко от коштрнтряи’ии, но и от ^ошического состава и конформации белка^
Если электрофорез проводили в кварцевых трубках, то гели можно сканировать, не извлекая их из трубок, по ультрафиолетовому поглощению белков (или нуклеиновых кислот, что значительно легче).
В этом случае необходимо тщательно очищать или перекри-сталлизовывать акриламид для уменьшения его собственного поглощения в ультрафиолетовой области спектра.
Другая возможность количественной регистрации электрофореграммы заключается в денситометрировании его фотографии. В этом случае ошибка в оценке истинного соотношения количеств белка в полосах может еще усугубиться за счет нелинейности чувствительности фотопленки и других особенностей фотографического процесса.
Наиболее надежным способом количественных измерений является счет радиоактивности в белковых полосах при условии однородности радиоактивной метки по всем компонентам смеси и обеспечения полноты выхода счета, о чем будет подробнее сказано ниже.
После окрашивания СВВ R-250 можно качественно, но вполне надежна обнаружить полосу, содержащую 10 мкг белка. На
порядок более высокую чувствительность окраски можно получить с помощью красителя СВВ G-250. Для этого используют относительно плохую его растворимость в хлорной кисЛоте. Готовят 0,04%-ный коллоидный раствор красителя в 3,5%-ном водном растворе НСЮ4, фильтрованием освобождаются от крупных, не растворившихся частиц. В полученном коричневом растворе вымачивают гель в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Сорбция на белке сдвигает равновесие в сторону диссоциации коллоидных частиц; краситель связывается с белком и окрашивает его в синий цвет (коричневая окраска была обусловлена наличием коллоидных частиц). На геле при этом краситель не сорбируется. Синеватые полосы белка проступают на бледно-коричневом фоне геля уже через 30 мин. По истечении 1,5 ч гель переносят в 5%-ный раствор уксусной кислоты. Интенсивность окраски полос при этом увеличивается, а фон становится прозрачным и светло-голубым — часто его можно не отмывать [Holbrook, Leaver, 1976]. Описан и другой вариант использования СВВ G-250: его растворяют сначала в 1 н. H2SO4, а затем в 12%-ной ТХУ [Blakesley, Boezi, 1977].
