Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Энгельгард Х. -> "Руководство по капилярному электрофорезу" -> 3

Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.

Энгельгард Х. Руководство по капилярному электрофорезу — Москва, 1996. — 112 c.
Скачать (прямая ссылка): rukovodstvopokapilyaram1996.pdf
Предыдущая << 1 .. 2 < 3 > 4 5 6 7 8 9 .. 130 >> Следующая

Глава 1
ГЕЛИ ДЛЯ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
ПОЛИАКРИЛАМИДНЫИ ГЕЛЬ (ПААГ)
Исходные материалы
Акриламид (СН2=СН—CONH2) представляет собой белый кристаллический порошок. Хорошо очищенный продажный препарат содержит не более 0,05% акриловой кислоты. Его 5%-ный водный раствор должен иметь pH не ниже 5, а оптическая плотность 1%-ного раствора при 290 нм (/42»о) не должна превышать 0,15. Такой препарат можно использовать без дополнительной очистки или перекристаллизации. Акриламид следует хранить сухим, в темной посуде, предпочтительно на холоду. В этих условиях он может храниться до года. Акриламид токсичен (воздействует на кожу и нервную систему), поэтому отвешивать и растворять его следует в перчатках и под тягой.
Недостаточно чистый препарат можно перекристаллизовать. Для этого 70 г акриламида растворяют в 1 л хлороформа при 50°, фильтруют при этой же температуре, затем охлаждают до —20°, быстро промывают кристаллы холодным хлороформом и высушивают в вакуум-эксикаторе. Для освобождения от УФ-по-глощающих примесей акриламид можно обработать активированным углем. Для этого в маточный 30—40%-ный водный раствор акриламида в смеси с метиленбисакриламндом добавляют
активированный уголь (примерно 50 г/л), суспензию перемешивают в течение 30 мин и фильтруют сначала через бумажный, а затем через стекловолокнистый фильтр. ¦
NN'-Метиленбисакриламид («Бис») — (СН2=СН—CONH)2-СН2 — используют в качестве «сшивки» линейных полимеров ак-риламида. Продажные препараты, содержащие не более 0,02% акриловой кислоты, не нуждаются в дополнительной очистке. В случае необходимости Бис можно перекристаллизовать из ацетона (12 г/л) в тех же условиях, что и акриламид. Условия хранения и токсичность — такие же, как у акриламида.
В качестве «сшивки» иногда используют этилендиакрилат — СН2= СН—СО—О—СН,—СН2—О—СО—СН=СНг, а также NN'-диаллилтартардиамид (ДАТД) —СН2=СН—СН2—NH—
СО—СН (ОН) —СН (ОН) —СО—NH—СН2—СН=СН2. С их помощью получают «растворимые» гели. В первом случае эфирную связь можно разорвать обработкой геля щелочью или водным раствором пиперидина. Гели, сшитые ДАТД, растворяются за 20—30 мин при комнатной температуре в 2%-ной йодной кислоте. Использование растворимых гелей на основе акриламида будет рассмотрено ниже.
Персульфат аммония производится в виде белого кристаллического порошка или гранул. Его используют в качестве инициатора процесса полимеризации. Гомолитический разрыв связи между атомами кислорода в молекуле персульфата аммония
MHj—О—S—О—О—S—О—nh4
¦. П ! II
приводит к образованию двух достаточно долго живущих свободных радикалов с одним неспаренным электроном у атома кислорода:
О
II
NHt—О—S—О'
II
О
Такой радикал стимулирует разрыв двойной связи в молекуле акриламида и присоединяется к ней таким образом, что снова образуется радикал с неспаренным электроном, но уже у атома углерода:
О н
II I
NH4—O-S-O-CHj-C II I
О CONH,
Этот радикал, в свою очередь, вызывает разрыв двойной связи и присоединение следующей молекулы акриламида с образова-
нием нового радикала и т. д. Цепная реакция полимеризации идет до тех пор, пока два радикала, встретившись между собой, не образуют обычную ковалентную связь. По тому же механизму в растущую цепочку линейного полимера может одной из своих концевых винильных групп встроиться и метиленбисакриламид. Второй его конец может точно так же оказаться в составе другой линейной полимерной цепочки, и образуется «сшивка».
Персульфат аммония в водном растворе Постепенно разлагается, поэтому следует использовать только свежеприготовленные растворы. Сухой препарат хранится лучше, хотя и он медленно разлагается с выделением кислорода. Продажные препараты для электрофореза обычно достаточно хорошо очищены, но их следует проверять. Если 1%-ный раствор персульфата аммония в воде имеет рН<2, то он непригоден. Отметим попутно, что катион не играет роли в процессе инициации. Можно с успехом использовать, например, персульфат калия.
Рибофлавин представляет собой кристаллы в виде желтооранжевых игл. Он малорастворим в воде, но хорошо растворяется в слабощелочных водных буферах; растворы имеют желто-зеленую окраску.
Рибофлавин также может служить инициатором полимеризации. При освещении его водного раствора видимым светом (445 нм) он присоединяет водород и восстанавливается до лей-корибофлавина. Последний снова легко окисляется растворенным в воде кислородом, образуя перекись водорода. За счет разложения перекиси продуцируются свободные радикалы (НО’), инициирующие цепную реакцию полимеризации акриламида.
К чистоте рибофлавина можно предъявлять не слишком строгие требования, так как он, являясь очень эффективным инициатором, используется в гораздо меньших концентрациях (~ 0,005%), чем персульфат аммония.
Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД)—(CHs) 2N—СНг—СНг— —N(CHj)» — представляет собой бесцветную жидкость с плотностью 0,78 г/см3. Концентрация неразбавленного ТЕМЕД — около 6,7 М.
Предыдущая << 1 .. 2 < 3 > 4 5 6 7 8 9 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed