Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Для характеристики электрофоретической подвижности бел-j ка в данных условиях электрофореза принято указывать отно^ шение расстояния, пройденного белковой полосой от начала р» бочего геля, к аналогичному расстоянию до полосы красителя в этом же геле. Это отношение, как и в хроматографии, обозначают Rf.
В качестве положительно заряженного красителя для электрофореза в кислой среде, когда белки мигрируют в направлении катода, используют метиловый зеленый или пиронйн.
(сн,),№
-€Ь
¦N(GH3)2
:N(CH
3'2
Метиловый зеленый
2 Cl
Пиронин
РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ПО РАЗМЕРАМ И ЗАРЯДУ
В этом случае в электродных резервуарах и для полимеризации ПААГ используют один и тот же буфер, поэтому такую систему иногда называют непрерывной, или простой. Строго говоря, непрерывность нарушается тем, что буфер, в котором вносят белковый препарат, с целью концентрирования исходной зоны разбавляют в 5—10 раз водой.
Подбор оптимальных условий электрофореза сводится к выбору следующих параметров: пористости геля и степени его сшивки, т. е. значений Г и С (см. главу 1); природы, концентрации и pH буфера; диссоциирующих добавок (если это необходимо); максимально допустимой мощности, напряжения и силы тока, а также продолжительности разделения; объема и концентрации исходного препарата; процедуры предварительной обработки препарата.
Выбор значений Г и С в зависимости от молекулярных масс разделяемых белков был подробно обоснован в главе 1. Чаще всего с белками работают при Т=3,5^20 и С=1ч-3.
Выбор рабочего буфера
Для обеспечения хорошей электрофоретической подвижности и сохранения вместе с тем ощутимых различий в суммарных (Электрических зарядах белков выбирают pH буфера, отличающийся на 3—4 единицы от среднего значения р/ для белков данного типа. Если эти значения неизвестны, то желательно составить себе представление о характере зарядов белков при различных pH по характеру их сорбции на ионообменных смолах.
Для кислых белков часто используют буфер с pH 8,9, для щелочных — с pH 4,3—4,5. В качестве слабощелочных буферов
для кислых белков применяют Трис-HCl, Трис-глициновый, Трис-боратный или Трис-барбитуратный. Для щелочных белков чаще всего используют К-ацетатный и Трис-ацетатный буферы, а иногда, если белок это выдерживает, то и просто уксусную кислоту в концентрации 0,9 М или 5% (0,9 М CHsCOOH имеет pH 2,4; 0,1 М — pH 2,87). О преимуществах буферов, не содержащих легко подвижных ионов (С1-, К+), было сказано выше.
Концентрацию буфера выбирают, исходя из допустимой мощности тепловыделения, и вместе с тем так, чтобы напряженность электрического поля в геле не превышала 15 В/см. При более высоких значениях напряженности возможны искажения формы белковых полос. Для 0,1 М Трис-глицинового буфера, например, такой напряженности отвечает плотность тока 20 мА/см2. Это означает, что через трубку диаметром 6 мм и длиной 8 см в этом случае можно пропускать ток до 5,5 мА при напряжении 120 В. Поскольку трубки довольно трудно охлаждать, обычно используют меньшие величины тока — около 3 мА на трубку. Для вертикальной пластины размером 10X14 см и толщиной 1,5 мм в этих же условиях сила тока составит около 30 мА при напряжении около 210 В. Разумеется, эти цифры приведены лишь для ориентировки, и для других условий электрофореза они окажутся иными. Впрочем, вариации для хорошо выбранных систем оказываются не очень значительными, так как для любой буферной системы сохраняется одна и та же тенденция — использовать максимально возможную напряженность поля при максимально допустимой с точки зрения теплоотвода мощности тока.
В двух приведенных простейших примерах напряженность поля в геле можно рассчитывать просто путем деления напряжения, указываемого источником тока, на длину геля. При этом пренебрегают падением напряжения в электродных резервуарах — на участке цепи между электродами и гелем. В том случае, когда электродные буферы находятся в непосредственном контакте с гелем, это вполне допустимо.
Иначе обстоит дело в приборах с горизонтально расположенными пластинами. Например, для электрофореза в приборе типа «Мультифор» при ширине пластины 20 см и толщине геля 1 мм плотности тока 20 мА/см2 соответствует его сила 40 мА. Падение напряжения в самом геле длиной 10 см при напряженности поля 15 В/см составит, очевидно, 150 В. Однако напряжение, которое надо установить на источнике тока, должно быть существенно выше ввиду значительного падения напряжения на фитилях, соединяющих буферные резервуары с гелем. Это падение напряжения трудно оценить, поэтому для выяснения значения! напряженности поля в самом геле прибор «Мультифор» снабжен? специальным вольтметром' измеряющим падение напряжения меЖду двумя точками поверхности геля, находящимися на опре' деленном расстоянии друг от друга. В рассмотренном примере использовали Трис-глициновый буфер с довольно высоким элект-
рическим сопротивлением. Мощностью/Расходуемая в приборе «Мультифор», в этом случае состав^т'всего лишь 6 Вт (150 ВХ Х0.04 А). Иная картина получится, если тот же гель заполиме-ризовать в 0,1 М Na-фосфатном буфере с pH 7,1. Электропроводность этого буфера довольно высока за счет легко подвижных ионов Na+. Измерения в том же приборе показывают, что уже при напряженности поля 5 В/см (падение напряжения — 50 В на пластину) плотность тока в геле возрастает до 100 мА/см2.Если довести напряженность поля в геле до 15 В/см, то сила тока через пластину сечением 2 см2 (20X0,1 см) составит 600 мА. При падении напряжения на геле, равном 150 В, это привело бы к совершенно неприемлемому уровню тепловыделения (мощность 90 Вт). Однако дойти до этого режима практически невозможно ввиду большого падения напряжения на фитилях, их разогрева, обсыхания и дальнейшего увеличения сопротивления. В итоге, при работе с фосфатным буфером приходится ограничивать силу тока (~200 мА) и работать при пониженных значениях напряженности электрического поля. Соответственно увеличивается и продолжительность электрофореза.
