Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Энгельгард Х. -> "Руководство по капилярному электрофорезу" -> 2

Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.

Энгельгард Х. Руководство по капилярному электрофорезу — Москва, 1996. — 112 c.
Скачать (прямая ссылка): rukovodstvopokapilyaram1996.pdf
Предыдущая << 1 < 2 > 3 4 5 6 7 8 .. 130 >> Следующая

Но есть, разумеется, и свои проблемы. Разделяемые макромолекулы все же находятся в растворе, поэтому возможна их диффузия, приводящая к размыванию зон. Это тем более серь-
езно, что протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла. К счастью, крупные молекулы белков и нуклеиновых кислот диффундируют не слишком быстро. Однако проблема теплоотвода и, главное, его равномерности по всему гелю очень важна еще и потому, что скорость миграции макромолекул в электрическом поле зависит от температуры. Неравномерность нагревания геля неизбежно приведет к искажению зон и ухудшению их разделения.
В ходе электрофореза зоны растворенных макромолекул остаются невидимыми. Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же знака, что и фракционируемые макромолекулы, но не взаимодействуют с ними. Краситель тоже передвигается в электрическом поле, но уже в виде окрашенной зоны. Его подбирают таким образом, чтобы скорость миграции наиболее подвижных макромолекул была несколько ниже, чем у молекул красителя. Когда окрашенная зона доходит до конца трубки, электрофорез прекращают.
Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффузии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и вымачивают в смеси кислоты со спиртом так, что белки или нуклеиновые кислоты выпадают в осадок в том самом месте, где закончилась их миграция в ходе электрофореза. После фиксации (или одновременно с ней) проводят окрашивание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют. На фотографии окрашенного цилиндрического ПААГ (рис. 2) хорошо видны четкие, узкие полосы разделившихся компонентов исходной смеси белков.
Вместо цилиндрических часто используют гели в виде тонких пластин, заполимеризованные между двумя плоскими стеклами. Такие пластины имеют важное преимущество: па них можно
одновременно фракционировать несколько препаратов. Обычно их вносят с одного края геля на равных расстояниях друг от друга. Каждый препарат разделяется в электрическом поле независимо от своих соседей, образуя свой набор зон. На фотографии такой пластины (рис. 3) хорошо видна серия параллельных «треков», исчерченных поперечными полосами окрашенных зон, в которых располагаются (в данном случае) олигонуклеотиды различной длины.
Вместо окрашивания или наряду с ним часто используют методы обнаружения разделенных зон по их радиоактивности. К ним относятся приемы регистрации полос на фотопленке посредством авторадиографии или флюорографии и различные способы счета радиоактивности в геле с помощью жидкостных сцинтилляционных счетчиков.
Преимущества пластин не ограничиваются экономией времени и места при обработке большого количества препаратов. Важнее другое: поскольку гель заливают в форму для полиме-
Рис. 2. Трубки с ПААГ после окончания электрофореза
Горизонтальные полоски — окрашенные белковые зоны
Рис. 3. Пластина агарозного геля после разделения фрагментов ДНК
Окраска люминесцентным красителем (бромистым этидкем)
ризации жидким, то его концентрация, состав буфера и содержание добавок строго одинаковы по всему сечению геля. Следовательно, плотность тока и напряженность электрического поля также одинаковы. Это обеспечивает строго идентичные условия фракционирования разных препаратов и дает возможность достоверного сопоставления их состава путем сравнения положения полос в параллельных треках. Если добавить к этому значительно более выгодные условия теплоотвода от тонкой пластинки геля по сравнению с цилиндром, то станет понятной исключительная популярность этой системы электрофореза в последние годы.
Фракционированием в ПААГ и агарозе не исчерпываются, современные методы электрофореза. В качестве «носителей» жидкой фазы широко используют также пленки из ацетата целлюлозы, фильтровальную бумагу, тонкие слои силикагеля, целлюлозы, сефадекса и др. В некоторых случаях, например для разделения низкомолекулярных веществ, эти системы имеют свои преимущества, однако для фракционирования белков, нуклеиновых кислот и их фрагментов в настоящее время используют почти исключительно гель-электрофорез, поэтому только он и будет подробно описан.
Рассмотрение начинается с характеристики исходных материалов и процессов их полимеризации. Затем, чтобы освободить дальнейшее изложение от повторений, будет описана техника приготовления гелей и соответствующая аппаратура. Гла-
в
ва 3 посвящена электрофорезу белков. После замечаний общего характера будут подробно рассмотрены различные современные приемы и варианты электрофореза. В отдельные разделы вынесены способы окрашивания, элюции из геля и регистрации радиоактивности фракционированных белков, поскольку эти приемы в большинстве своем одинаковы для всех вариантов электрофореза. Главу заключает описание способов препаративного разделения белков. Такая же структура изложения принята для рассмотрения электрофореза нуклеиновых кислот (глава 4). Замечания общего характера, изложенные в предыдущей главе, во многом относятся к фракционированию обоих типов биополимеров, поэтому здесь будут рассмотрены только специфические особенности электрофореза нуклеиновых кислот. В обеих последних главах для иллюстрации различных экспериментальных приемов электрофоретического разделения биополимеров разбираются многие новейшие работы. Разумеется, при этом приводятся только наиболее существенные данные. Более детальное описание следует искать в оригинальных публикациях, на которые будут даны ссылки.
Предыдущая << 1 < 2 > 3 4 5 6 7 8 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed