Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Энгельгард Х. -> "Руководство по капилярному электрофорезу" -> 18

Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.

Энгельгард Х. Руководство по капилярному электрофорезу — Москва, 1996. — 112 c.
Скачать (прямая ссылка): rukovodstvopokapilyaram1996.pdf
Предыдущая << 1 .. 12 13 14 15 16 17 < 18 > 19 20 21 22 23 24 .. 130 >> Следующая

Выбор буфера рабочего геля
Вернемся к зависимости тока и напряженности поля в геле от природы и концентрации рабочего буфера. Заметим сразу, что сама по себе величина pH практически не сказывается на электропроводности геля. Даже при pH 4 концентрации протонов (0,1 мМ) не даст заметного вклада в электропроводность по сравнению с ионами буфера, концентрация которых, как будет видно дальше, как минимум в 100 раз выше. То же относится и к ионам ОН- в реально используемом диапазоне pH щелочных буферов,
В то же время косвенным образом быбор pH может сильно влиять на электропроводность данного буфера, определяя степень диссоциации его ионов. Рассмотрим широко используемый Трис-НС1-буфер. В нем всегда находятся ионы Трис+, С1~ и незаряженные молекулы Триса. Для этого буфера р/Со=8,1. Это означает, что при pH 8,1 ровно половина молекул Триса несет положительный заряд, практически целиком за счет протонов соляной кислоты, которой титровали буфер. Очевидно, что в растворе находится такое же количество ионов CI-. Таким образом, при pH 8,1 0,1 М Трис-HCl содержит 0,05 М Трис+ и 0,05 М С1_. Электропроводность этого буфера будет определяться, в основном, ионами С1~, так как их подвижность намного выше, чем у тяжелых ионов Трис+. 0,05 М С1~ обеспечивает достаточно высокую электропроводность. Трис-ацетатный буфер такой же концентрации и pH имеет значительно меньшую элект[?опровод-ность, так как подвижность аниона СН3СОО_ явно ниже, чем Cl-
При pH 6,7 электропроводность 0,1 М Трис-HCl увеличится примерно вдвое, так как этот pH лежит вблизи границы буферной емкости Триса и почти все его молекулы будут ионизированы; следовательно, концентрация С1_ составит около 0,1 М. Наоборот, при pH 8,9 электропроводность этого буфера значительно ниже, чем при pH 8,1, так как для титрования до pH 8,9 потребуется заметно меньше НС1.
Существенную роль в определении электропроводности играет выбор природы буфера, т. е. характера его ионов. Легко понять, что К- или Na-фосфэтные буферы, как и Трис-HCl, отличаются высокой электропроводностью за счет ионов К+ и Na+. То же относится к К- или Na-ацетатным буферам. Между тем электрофорез в чистой уксусной кислоте умеренной концентрации не связан с высокой электропроводностью. Имидазол-фос-фатный буфер той же молярности, что и К-фосфатный, отличается меньшей электропроводностью. Относительно низкую электропроводность имеют Трис-боратный, Трис-глициновый и Трис-барбитуратный буферы. Вообще, можно утверждать, что электропроводности буферных систем, в которых не участвуют легкоподвижные ионы сильных неорганических кислот и щелочей, относительно невелики. Это важное заключение будет играть существенную роль в дальнейшем изложении. К сожалению, такие буферы нередко отличаются и меньшей емкостью.
Таким образом, электропроводность рабочего буфера определяется тремя факторами: концентрацией, необходимой для поддержания нужного pH в белковых зонах, степенью диссоциации буферных веществ при этом pH и характером участвующих в диссоциации ионов.
Очевидно, что буфер геля не должен содержать посторонних солей даже в малых концентрациях. Соль, зачастую присутствующую в исходном препарате, несмотря на его малый объем, следует предварительно удалить или хотя бы снизить ее концентра-
Цйю до 6,Й5 М. На избыток солй 6 np6naf)af? указЫйаёТ, меЖду прочим, размытый характер передней границы и резкая задняя граница полосы препарата сразу после его вступления в гель. При нормальном разделении должна иметь место как раз обратная картина — резкая передняя и более диффузная задняя граница полосы. Это можно проконтролировать путем окрашивания пробного геля через 20—30 мин после начала электрофореза или при использовании люминесцентных маркеров (см. ниже).
Помимо суммарной электропроводности, определенную роль играет электрофоретическая подвижность ионов буфера, мигрирующих в том же направлении, что и разделяемые макромолекулы. Качество полос выигрывает, если эти ионы по своей подвижности приближаются к самим макромолекулам. Таковы большие органические ионы: Трис+ (катион), остатки барбитуровой и какодиловой кислот (анионы) и такие цвиттерионы, как глицин и аланин. Следовательно, при прочих равных условиях Трисовый буфер следует предпочесть при фракционировании щелочных белков, а барбитуратный — для кислых белков вблизи нейтральной области pH буфера.
Выделение тепла при электрофорезе
Высокая электропроводность буфера нежелательна, поскольку ограничивает возможность повышения напряженности электрического поля в геле из-за увеличения тока и связанного с этим выделения тепла. Между тем, именно напряженность поля обеспечивает всегда желательное ускорение миграции белков.
Электрическая мощность, рассеиваемая в виде тепла в геле, равна произведению силы тока на падение напряжения по длине геля (IE). В главе 1 было отмечено, что разумной продолжительности электрофореза соответствует напряженность поля 10—20 В/см. Кстати, как показывает практика, при заметном превышении этих значений качество полос в обычных условиях охлаждения ухудшается. Для геля длиной 20 см такой напряженности соответствует напряжение 200—400 В. При воздушном охлаждений вертикально расположенных пластин эффективный теплоотвод возможен при рассеиваемой мощности не более 20 Вт, что соответствует силе тока 50—100 мА на пластину. В приборе GE-2/4 фирмы «Pharmacia» ^(рис. 15) с принудительным жидкостным охлаждением пластин уровень мощности может быть увеличен до 100 Вт с соответствующим повышением напряженности поля и ускорением фракционирования белков. Приборы для электрофореза в горизонтальных пластинах успешно осуществляют теплоотвод при мощности до 40 Вт.
Предыдущая << 1 .. 12 13 14 15 16 17 < 18 > 19 20 21 22 23 24 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed