Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Для однозначного определения молекулярной массы белка по скорости его миграции при электрофорезе бывает целесообразно распрямить полипептидную цепочку белка и придать ей жесткость. Именно такой прием используется при электрофорезе белков, обработанных додецилсульфатом натрия (подробно это будет рассмотрено ниже).
Напряженность электрического поля (Н)
Разность потенциалов, или напряжение, приходящееся на весь гель, обозначим через Е; тогда для однородного участка геля длиной I Е — Н1. В проводящей ток жидкости приложенному напряжению Е всегда отвечает некоторая сила тока /, которая в соответствии с законом Ома определяется суммарным
сопротивлением цепи R (I—EIR). В ПААГ проводящей жидкостью служит буфер, находящийся между нитями полимера. Свой вклад в проводимость вносят и мигрирующие в геле заряженные макромолекулы, но ввиду их низкой концентрации этим вкладом можно пренебрегать.
Электрическое сопротивление буфера определяется двумя факторами: концентрацией в нем свободных ионов и их электрофоретической подвижностью. Второй фактор играет очень важную роль. Например, при одинаковых концентрациях в двух буферах ионов С1~ и CHjCOO" электропроводность первого буфера будет заметно выше, чем второго. Следует также помнить о том, что электрический ток одинаков по всей длине электрической цепи, т. е. в любом сечении трубки или пластины. Разрывов или скачков тока по длине геля физически быть не может, это аксиома. Иначе обстоит дело с напряжением или напряженностью электрического поля.
Если в любой электрической цепи последовательно включены два различных по своей величине сопротивления Rt и Rit то одинаковый для всей цепи ток / протекает через первое из них за счет падения на нем напряжения El = IRl, а через второе — за счет E2=IR2. Полное напряжение по всей электрической цепи Е=Е±+Ег. Если Ri сильно отличается от /?2, то и также отличается от Ег. При изменении сопротивлений двух участков распределение напряжений на них может существенно измениться, оставаясь в сумме своей неизменным.
Такая ситуация может возникать в ПААГ, состоящем из двух последовательно расположенных участков, где при полимеризации были использованы разные буферы (содержащие ионы с разной подвижностью или просто различающиеся по концентрации). Сопротивления этих участков могут оказаться разными: следовательно, различными могут быть и падения напряжения на них, но эти параметры зависят от длины участков. Однако заведомо будут различаться в рассматриваемом случае значения напряженности поля на двух участках. Действительно, падение напряжения на участке пропорционально его сопротивлению, а следовательно, длине участка. Напряженность же поля есть результат деления падения напряжения на длину, поэтому соотношение напряженностей поля на двух участках геля не зависит от их длины и определяется только концентрациями и подвижностями содержащихся в них ионов. Это — очень важный вывод. В реальных буферных системах геля такую ситуацию можно себе представить в двух простейших вариантах.
Вариант 1. Предположим, что буферы и, соответственно, ионы на двух участках геля (Л и В) одинаковы, но концентрация буфера на участке Л в 10 раз меньше. Это приведет к тому, что напряженность поля в А будет вдесятеро больше, чем в В. Скорость миграции ионов пропорциональна напряженности поля, и ионы на участке А будут мигрировать в 10 раз быстрее, чем такие же ионы на участке В; это компенсирует разницу в их
концентрациях. Число ионов, проходящее за 1 с через любое сечение обоих участков, а также через границу между ними, будет одинаковым, что и означает неизменность тока 1 по всей длине составного (ступенчатого) геля. При этом предполагается, что количество ионов в Л не истощается — оно пополняется за счет ионов, поступающих из электродного буфера.
Вариант 2. Теперь допустим, что концентрации ионов на обоих участках одинаковы, но ионы на участке А отличаются намного меньшей электрофоретической подвижностью. Речь идет
о подвижности в свободной жидкости (и0), так как сетка геля не препятствует миграции малых ионов. Например, пусть в геле А содержатся отрицательные ионы глицина (при щелочном pH), а в геле В — ионы хлора. Меньшая подвижность ионов обусловливает большую величину сопротивления. Суммарное напряжение распределится между участками А и В так, что напряженность поля в А будет соответственно выше, причем именно настолько, чтобы CKopoefb миграции ионов глицина, пропорциональная произведению подвижности на напряженность поля, стала точно такой же, как и у ионов хлора. Этого опять требует условие неизменности величины тока вдоль всего геля.
В более сложных случаях могут различаться как подвижности ионов, так и их концентрации, но в любом случае напряженности электрического поля в двух последовательно расположенных участках геля устанавливаются такими, что они компенсируют все различия и обеспечивают постоянство тока во всем геле. Значения напряженности могут при этом оказаться очень разными. Очень важно, что это различие существенным образом влияет и на соотношение скоростей миграции одних и тех же белков (или нуклеиновых кислот) в двух участках геля. На том участке, где напряженность поля выше, белки будут двигаться быстрее, чем на соседнем. Эта любопытная ситуация будет рассмотрена ниже при обсуждении проблемы сужения белковых зон для противодействия диффузии. В заключение заметим, что сам процесс электрофореза в рабочем геле следует вести в однородном по напряженности электрическом поле, чтобы разделение белков отражало истинное различие их собственных характеристик — молекулярных масс и электрического заряда.
