Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
¦ Недавно был предложен очень простой, целиком (включая пластины для геля) изготовленный из плексигласа прибор для вертикального электрофореза в пластинах [Broadmeadow, Wil-се, 1979]. В нем используется схема Стадиера, но пластины по всей высоте омываются и охлаждаются с обеих сторон электродным буфером. Верхний и нижний буферы непрерывно перемешиваются и охлаждаются, проходя через находящийся вне прибора змеевик. Этим компенсируется худшая, чем у стекла, теплопередача через плексиглас. Для гелей малой концентрации этот прибор, по-видимому, непригоден ввиду относительно слабого сцепления ПААГ с плексигласом.
Некоторые фирмы используют для пластин такой же способ установки в прибор, что и для трубок. Пластины вставляют снизу через прорези в дне верхнего электродного резервуара. Уплотнение осуществляют при помощи резиновых прокладок прямоугольного сечения. Собранные формы с гелем закрепляют за счет трения в прорезях прокладок («Bio-Rad», «Pharmacia») либо прижимают к ним шлифованными торцами («Desaga»). В любом случае пластины должны быть изготовлены точно, поэтому приходится ограничиваться использованием фирменных пластин и гелей определенной толщины.
Необходимость интенсивного теплоотвода от большой по-, верхности пластин заставляет некоторые фирмы вводить в прибор для электрофореза змеевик с охлаждающей жидкостью и насос, обеспечивающий циркуляцию электродных буферов. Впрочем, в случае тонких гелей воздушное охлаждение оказывается вполне достаточным. Протекающий ток нагревает гель до некоторой равновесной температуры, но в тонком слое геля эта температура оказывается практически одинаковой по всему его сеченик}. Именно это обстоятельство является решающим для обеспечения хорошего качества разделения.
В приборе Стадиера можно обойтись и без вырезов в стенке и пластине, а также без уплотнения, если электрическую цепь между верхним буфером и гелем замкнуть через смоченные тем же буфером фитили из фильтровальной бумаги [De Wachter, Fi-ers, 1971]. Конструкция прибора становится совсем простой, и отпадает необходимость делать вырезы в стеклянных пластинах. Тем не менее этот способ нельзя рекомендовать во-всех случаях аналитического электрофореза, так как он имеет однн недоста-
ток: открытые фитили могут неконтролируемым образом несколько обсыхать. Это приводит к изменению их электрического сопротивления, а следовательно, напряжения и тока, текущего через гель (см. ниже).
По окончании электрофореза пластины разнимают, отслаивая одну из них от геля с помощью шпателя. Его всовывают между пластинами со стороны карманов и слегка поворачивают. Эту операцию не следует форсировать; лучше сначала пройти шпателем с легким нажимом вдоль всего края пластины, наблюдая за тем, как между стеклом и гелем постепенно проникает воздух, а потоц уже приподнять пластину. Со второй пластины гель снимают руками и переносят в ванночку для фиксации или окраски. Хотя всегда есть возможность поднять гель с пластины за «нерабочий» конец, лучше все же работать в перчатках. Случайное прикосновение кожи рук к рабочей поверхности геля при современных чувствительных методах окрашивания может оставить на геле артефактное белковое пятно. При авторадиографии влажный гель, лежащий на’ одной пластине, можно прямо заворачивать в полиэтиленовую пленку.
ГОРИЗОНТАЛЬНО РАСПОЛОЖЕННЫЕ ПЛАСТИНЫ
Преимущество такого расположения — не только в компактности прибора, но и в отсутствии проблемы уплотнения. Оба электродных буфера находятся в резервуарах, расположенных ниже уровня горизонтального столика, на который кладут гель. Естественно, что этот столик используется и для отвода тепла от пластинки геля — в его каналах циркулирует охлаждающая вода.
Гель, полимеризованный на тонкой стеклянной пластинке, помещают на столик открытой поверхностью кверху, поскольку препарат вносят не с торца геля, а в ряд специальных «колодцев», расположенных на некотором расстоянии от его края. Электрическая цепь замыкается через 8—10-слойные фитили из фильтровальной бумаги, одним концом погруженные в электродные резервуары, а другим — прижатые к гелю с перекрытием в 10—12 мм (рис. 10, 11). При наложении фитилей на гель следует внимательно следить за отсутствием воздушных пузырей между ними.
Показанные на рис. 10 перегородки в электродных камерах препятствуют конвекционному переносу продуктов электролиза от электродов к концам фитилей. В ходе электрофореза на аноде образуется свободная кислота, а на катоде — щелочь, которые по плотности отличаются от электродных буферов, а это может вызвать конвекцию. Если электрофорез идет более 24 ч, электродные буферы следует заменять. Если же они одинаковы и между электродными резервуарами обеспечена циркуляция жидкости, то кислота и щелочь взаимно нейтрализуются — и буфер можно не заменять. В изображенном на схеме приборе
«Мультифор» (LKB, Швеция) циркуляция буфера не предусмотрена, но объем каждой камеры составляет 1,2 л.
Во избежание подсыхания фитилей и геля прибор во время работы закрывают прозрачной крышкой (рис. 12), которую иногда называют антиконденсационной. Она предохраняет гель в случае существенного охлаждения от конденсации на его поверхности влаги из окружающего воздуха. Впрочем, сама крышка изнутри может запотевать за счет влаги, испаряющейся с фитилей, особенно в случае их перегрева. Это ухудшает условия наблюдения за ходом электрофореза, поэтому в аналогичном по конструкции приборе фирмы «Bio-Rad» (модель 1415) по периметру крышки у ее краев с внутренней стороны проходит трубка с охлаждающей водой. Пары влаги конденсируются на трубке, оставляя крышку прозрачной. Электродные резервуары у этого прибора съемные, что облегчает их промывку. В качестве фитилей используется специально обработанная целлюлоза с повышенной влагоемкостью.
