Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Однако ротор с вертикальными пробирками можно успешно использовать и для зонально-скоростного центрифугирования вместо бакет-ротора. В отличие от углового ротора относительно тяжелые частицы не будут здесь попадать на стенку пробирки вплоть до момента прохождения ими всего градиента плотности. Приведенные выше рассуждения о том, что стенка пробирки углового ротора не влияет на образование градиента плотности солевого раствора, не относятся к поведению фракционируемых частиц при зонально-скоростном центрифугировании, ведь плотность этих частиц заведомо больше, чем максимальная плотность раствора сахарозы. Попав в любой части пробирки на ее стенку, частицы, а тем более их агрегаты, будут легко соскальзывать по стенке на дно пробирки. Всего этого не будет в вертикально стоящей пробирке.
После формирования градиента плотности раствора сахарозы в вертикальной пробирке на него, как обычно, наслаи^ вают раствор исходного препарата. Находясь в растворе сахарозы малой концентрации, препарат в ходе переориентации градиента оказывается распластанным вдоль ближайшей к оси ротора стенки пробирки. Толщина его слоя при этом уменьшается в несколько раз, что способствует лучшему разделению зон. Для того чтобы к моменту начала осаждения частиц слой препарата отошел от стенки пробирки и принял оптимальную форму прямоугольного сечения, на него предварительно наслан-
9 Л. А. Остерман
257
вают небольшое количество буфера или масла, как это практикуется для зональных роторов.
Для того чтобы наиболее тяжелые частицы не попали на дальнюю от оси вращения стенку пробирки, где они могут образовать осадок и не сняться при реориентации градиента, на дно пробирки предварительно помещают «подушку» из концентрированного раствора сахарозы или максиденса (см. выше). После окончания центрифугирования и реориентации тяжелые частицы будут лежать на этой подушке.
Ввиду весьма кардинальной перестройки градиента при разгоне и остановке использование роторов с вертикальными пробирками требует особенно плавного протекания этих процессов. В современных центрифугах для этой цели предназначены специальные устройства.
Таким образом, на практике в настоящее время бакет-рото* ры используют для зонально-скоростного центрифугирования, угловые — для равновесного, а роторы с вертикальными пробирками — как для того, так и для другого. Для сбора осадков при дифференциальном центрифугировании одинаково пригодны как угловые, так и бакет-роторы, а роторы с вертикальными пробирками неудобны: осадок образуется не на дне. а вдоль образующей цилиндрической части пробирки.
Следует еще раз обратить внимание на важность выбора материала пробирок для угловых роторов и роторов с вертикальными пробирками при равновесном центрифугировании в солевом градиенте, особенно в том случае, когда градиент заполняет лишь часть объема пробирки и на него наслаивают масло. Нагрузка на пробирку в поперечном направлении оказывается очень значительной и неравномерной. Пробирки из более жестких материалов (полипропиленовые и поликарбо-натные) могут трескаться, поэтому предпочтение следует отдать прочным и пластичным полиалломерным пробиркам.
Фракционирование и детектирование равновесных градиентов
Эти операции при равновесном центрифугировании производятся с помощью тех же приемов, что и при зонально-скоростном. Фракционировать лучше всего вытеснением вверх с использованием максиденса. CsCl растворим в хлорной кислоте, поэтому нуклеиновые кислоты после фракционирования в градиенте CsCl удобно осаждать добавлением НС104 до 10%. При концентрации ниже 2,3 М (30%) CsCl не осаждается даже при добавлении двух объемов этанола, который осаждает цезиевую соль нуклеиновой кислоты. После предварительного разбавления ее можно перевести в натриевую на колонке со смолой «Dowex 50>> в Na+—форме.
Некоторые сложности могут возникнуть при определении радиоактивности во фракциях. CsCl и метризамид являются сильными тушителями сцинтилляторов на основе диоксана и
нафталина, поэтому для них следует йёпользбвать толуоЛ-трй-тоновые сцинтилляторы. При работе с градиентами плотности оастворов Cs2S04 следует учитывать способность иона сульфата осаждать большинство сцинтилляторов. В этом случае фракции после градиента необходимо разбавлять в 20 раз либо удалять Cs2S04 осаждением или гельфильтрацией.
Растворы KI и Nal при внесении в сцинтиллятор требуют защиты от окисления. .Эти растворы также сильно поглощают свет в ультрафиолетовой области, мешая денситометрии нуклеиновых кислот. Зато бромистый этидий не влияет на плавучую плотность нуклеиновых кислот, поэтому в растворах КД и Nal его удобно использовать для окраски препаратов.
Примеры центрифугирования в градиентах плотности растворов CsCl
Разделить нативную и денатурированную ДНК простым равновесным центрифугированием в градиентах CsCl и Cs2S04 не удается, поскольку различие в плавучих плотностях этих ДНК слишком мало. Актиномицин D образует комплекс только с нативной ДНК, снижая ее плотность, но он присоединяется предпочтительно к ГЦ-богатым участкам ДНК, что снижает ценность его использования для разделения однонитевых и двунитевых молекул.
