Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Концентрация: р, г/см* п Концентрация: р, г/см* п
мае. % моль/л мае. % моль/л
Ю 0,64 1,079 1,3405 50 4,70 1,582 1,3885
20 1,391 1,174 1,3498 60 6,36 1,785 1,4072
30 2.28J 1,286 1,3607 65,1 7,40 1,910 1,4185
40 3,37' 1,420 1,3735 (насыц.)
Более подробные данные можно найти в справочниках. Для практических целей вполне достаточно по приведенным здесь данным построить кривую зависимости плотности от концентрации и пользоваться ею при приготовлении исходного раствора для равновесного центрифугирования.
Для точного определения плотности по коэффициентам преломления во фракциях после «раскапывания» градиента (а это необходимо делать хотя бы из-за искажения градиента в прочесе остановки ротора; см. выше) можно пользоваться следующими соотношениями: р20 = 10,928яго—13,593 (при 20°); р25= 10,860п25 —13,497 (при 25°). В частности, плотности р= = 1,7 г/см* отвечает концентрация 56 мас.%, или 5,65 М CsCl.
Проще всего брать навеску сухого CsCl, численно равную (в граммах) выбранной концентрации раствора в массовых процентах, и добавлять водного буфера до 100 г. Можно пользоваться и насыщенным раствором CsCl. Для этого 700 г CsCl растворяют с подогревом в 300 мл воды, остуживают до 25° и сливают с осадка. Если нужно приготовить объем V раствора CsCl плотностью р, то следует отмерить объем концентрированного раствора К„= К(р— 1)/0,91 и добавить объем буфера
V6y*== V—V„. Приготовление растворов первым способом дает более точные значения р. Если препарат имеется в виде разбавленного раствора в буфере, то расчетное количество CsCl вносят прямо в этот раствор.
При точном определении плотности по коэффициенту преломления п надо учитывать вклад буфера. Он может быть несущественным в отношении плотности, но заметным в отношении п. Следует измерить п буфера и рассчитать п раствора CsCl (в воде) по соотношению: пСвс1 = пваел— (пбуф—пводы). До измерения п во фракциях после раскапывания градиента их не следует держать в открытых пробирках вследствие испарения воды. Необходимо также внимательно следить за температурой рефрактометра.
Буфер для образования градиента плотности CsCl выбирают в соответствии с задачей эксперимента. В простейшем случае это может быть 0,01 М Трис-НС1(рН 7) с 5 мМ ЭДТА.
Преформирование градиента
Для ускорения формирования равновесного градиента концентрации CsCl имеет смысл непосредственно перед центрифугированием провести преформирование градиента в центрифужных пробирках. Разумеется, это имеет смысл делать только в тех случаях, когда фракционируют частицы с достаточно большими значениями s20,w> так что продолжительность центрифугирования определяется именно формированием градиента, а не миграцией частиц к положениям равновесия.
Сначала выбирают среднее значение плотности р0, например 1,7 г/см3. Затем, в зависимости от предполагаемого различия плотностей компонентов смеси, задают интервал плотности — разность ее значений у дна и у мениска градиен*га после его формирования, например Ар=0,24 г/см3. Объем градиента определяется также заранее. Для ротора SW50.1 при заполнении пробирок целиком можно взять объем 5 мл.
Чаще всего ограничиваются трехступенчатым преформиро-ванием градиента. Готовят три раствора CsCl плотностью Ро+Др/2, р0 и р0—Ар/2. Равные объемы этих растворов осторожно наслаивают один за другим в указанном порядке в центрифужную пробирку так, чтобы суммарный объем был равен выбранному объему градиента. Все растворы приготовлены на одном и том же буфере и содержат фракционируемую смесь частиц в одинаковой концентрации. Последнее, впрочем, необязательно. Если необходимо очистить препарат и ориентировочное положение его полосы на градиенте известно заранее, то Целесообразнее весь исходный материал внести в одну «ступень» градиента.
Иногда градиент разбивают на пять ступеней. Для выбранного примера — это пять ступеней по 1 мл со следующими значениями плотности: р1 = р0+Др/2= 1,7+0,12= 1,82; рг=Ро+Ар/4=
= 1,7+0,06=1,76; р3=ро= 1,7; р*=р0—Ар/4= 1,7—0,06= 1,64; р5.—р0 -- Др/2= 1,7—0,12= 1,58 г/см3.
Легко видеть, что средняя плотность раствора CsCl останется равной 1,7 г/см3, но ступенчатое преформирование участков с нарастающей ко дну плотностью растворов в несколько раз сократит время формирования плавного равновесного градиента по всей пробирке.
Линейный градиент плотности раствора CsCl можно префор-мировать с помощью такого же смесителя градиента, какой был описан ранее при рассмотрении градиентов плотности сахарозы. Тяжелая жидкость должна иметь плотность р0+Др/2, а легкая р0 —Др/2. Обязательно надо позаботиться о том, чтобы площадь основания цилиндра, содержащего тяжелую жидкость (обычно смесителя), была больше площади основания второго цилиндра (резервуара) в соответствии с отношением плотностей двух жидкостей. Для приведенного выше примера это отношение равно 1,82: 1,58=1,15. Можно рассчитать, что для создания такого соотношения площадей (в случае цилиндров равных диаметров) в резервуар придется вставить палочку, диаметр которой равен 0,36 диаметра цилиндра.
