Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Энгельгард Х. -> "Руководство по капилярному электрофорезу" -> 113

Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.

Энгельгард Х. Руководство по капилярному электрофорезу — Москва, 1996. — 112 c.
Скачать (прямая ссылка): rukovodstvopokapilyaram1996.pdf
Предыдущая << 1 .. 107 108 109 110 111 112 < 113 > 114 115 116 117 118 119 .. 130 >> Следующая

Совершенно иная картина наблюдается, при равновесном центрифугировании биополимеров в растворах метризамида, который практически йе связывает воду. Плавучая плотность нуклеиновых кислот в этом случае оказывается в пределах
1,12—1,17 г/см3. Вытекающие отсюда возможности и особенности равновесного центрифугирования в градиенте метризамида рассмотрены ниже. Здесь же уместно качественно сопоставить картины распределения разных классов нуклеиновых кислот в равновесных градиентах плотности растворов различных солей при одинаковых режимах центрифугирования (рис. 64). Это позволит, в частности, еще раз обратить внимание на различия крутизны соответствующих градиентов, изображенных в одинаковом масштабе.
В рассматриваемом случае центрифугирование проводили в роторе MSE 10X10 Ti при частоте вращения 45 тыс. об/мин и 25° в течение 68 ч. Вносили по 4,6 мл исходного раствора соли, содержащего 5—10 мкг меченной по 3Н смеси нуклеиновых кислот. Начальные плотности солевых растворов р0 были выбраны так, чтобы в каждом случае разделить максимальное число различных классов нуклеиновых кислот. Например, для градиента CsjS04 оно равно четырем: от нативной ДНК до РНК. При центрифугировании в градиентах CsCI и Nal РНК оказывается в осадке на дне пробирки. Любопытно различие в относительном расположении пика гибрида ДНК — РНК для градиентов растворов солей цезия и Nal. Можно предполо-
жить, что здесь сказывается взаимодействие ионов с молекулами гибридной нуклеиновой кислоты [Birnie, 1978].
При использовании концентрированных растворов солей для создания градиентов плотности необходимо учитывать их активность в качестве диссоциирующих агентов. Это весьма существенно при центрифугировании белков (которые могут денатурировать и выпадать в осадок), но особенно пагубно влияет на нуклеопротеиды (например, рибосомы), которые диссоциируют. То же самое относится к мультиферментам и другим белковым комплексам, состоящим из нековалентно связанных субъединиц. Нуклеопротеиды и белковые комплексы можно анализировать центрифугированием в солевых градиентах только после их предварительной сшивки формальдегидом или глу-таровым альдегидом, однако это, естественно, несколько изменяет их седиментационные характеристики и лишает эти вещества биологической активности.
Еще одно неудобство использования концентрированных солевых растворов связано с их способностью осаждать некоторые детергенты, в частности ДДС-Na. Его следует заменять саркозилом, который значительно лучше растворяется в концентрированных растворах солей.
Следует помнить, что в продажных препаратах солей могут содержаться примеси тяжелых металлов, которые образуют комплексы с нуклеиновыми кислотами, существенно изменяя их свойства. Поэтому, если нет уверенности в полной чистоте соли, ее раствор следует пропустить через колонку хелатной смолы (например «Chelex-100* фирмы «Bio-Rad»), объем которой должен быть приблизительно в 10 раз меньше, чем объем солевого раствора. Во избежание забивания колонки нераство-ряющимися кристаллами раствор надо предварительно отфильтровать ч^рез стекловолокнистый фильтр GF/C. В градиентный раствор, как правило, вносят также ЭДТА в концентрации 1 —
10 мМ. Всю посуду рекомендуется промывать водой, очищенной от следов тяжелых металлов также на хелатных колонках.
С другой стороны, образование комплексов некоторых тяжелых металлов (Ag+, Hg*+) с нуклеиновыми кислотами в определенных условиях носит избирательный характер и может быть использовано для создания различий в плавучей плотности разных типов нуклеиновых кислот. Этот и другие приемы целенаправленной модификации плавучей плотности нуклеиновых кислот (например, путем присоединения некоторых антибиотиков или красителей) будут рассмотрены ниже.
Иногда с целью денатурации и разрушения вторичной структуры белков и нуклеиновых кислот солевые градиенты используют в сочетании с гуанидинхлоридом, мочевиной, формамидом или диметилсульфоксидом. Эти вещества следует тщательно очищать от посторонних ионов, пропуская их растворы через колонку деионизирующей смолы типа AG 501X8. Для нейтрализаций неизбежно образующегося при использовании мочеви-
ны цианата в состав градиентного раствора вводят буфер (например, 10 мМ Трис-HCl).
Ниже рассмотрены особенности каждого из названных солевых градиентов. Различные технические аспекты их приготовления и использования подробно проанализируем на примере самого распространенного — градиента плотности растворов CsCl. Затем отметим особенности и принципиальные отличия других солевых градиентов. Отдельно остановимся на равновесном центрифугировании в градиентах плотности растворов метризамида.
ГРАДИЕНТЫ ПЛОТНОСТИ РАСТВОРОВ CsCl
Эти градиенты используются в основном для фракционирования ДНК, реже — для разделения белков или фиксированных формальдегидом нуклеопротеидов. Иногда их применяют для очистки малых количеств РНК, оседающей на дно пробирки.
Ниже приведены некоторые значения плотности (р) и коэффициента преломления п (при 25°) водных растворов CsCl в зависимости от их концентрации в массовых процентах и молях на литр:
Предыдущая << 1 .. 107 108 109 110 111 112 < 113 > 114 115 116 117 118 119 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed