Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Энгельгард Х. -> "Руководство по капилярному электрофорезу" -> 109

Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.

Энгельгард Х. Руководство по капилярному электрофорезу — Москва, 1996. — 112 c.
Скачать (прямая ссылка): rukovodstvopokapilyaram1996.pdf
Предыдущая << 1 .. 103 104 105 106 107 108 < 109 > 110 111 112 113 114 115 .. 130 >> Следующая

РАВНОВЕСНОЕ (ИЗОПИКНИЧЕСКОЕ) ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
Идея метода состоит в создании такого градиента по длине пробирки, чтобы плотность у дна была больше, чем у наиболее плотных, а у мениска — меньше, чем у наименее плотных частиц фракционируемой смеси. При достаточно длительном центрифугировании частицы будут двигаться вдоль градиента до тех пор,
пока не достигнут положения, в котором плотность среды равна их плавучей плотности. Движение прекратится, частицы разной плотности расположатся в различных участках градиента, т. е. будет осуществлено их фракционирование по плотности.
По крайней мере, пять особенностей такого разделения можно предсказать сразу.
1. Процесс центрифугирования должен быть длительным, так как при подходе к положению равной плотности (изопикни-ческому положению) частицы будут двигаться замедленно.
2. Вязкость среды вследствие этого является нежелательным фактором.
3. Размеры частиц и, следовательно, их масса не скажутся на окончательном распределении. Положение на градиенте определяется только их плотностью, хотя начальная скорость миграции из области иной плотности градиента будет больше у тяжелых частиц.
4. Частицы будут двигаться к положению равновесия как из области более низкой плотности градиента, чем их плавучая плотность, так и из области более высокой плотности. Таким образом, наряду с седиментацией, может происходить и флотация. Это означает, что нет необходимости наносить тонкий начальный слой препарата и можно даже смешать его со всем объемом градиента.
5. Из сказанного следует, что при равновесном центрифугировании допускается более высокая емкость загрузки препаратом, чем при зонально-скоростном, и нет опасности образования локальных участков обратного градиента (см. выше).
В области равновесия частицы будут располагаться в виде полосы, ширина которой определится соотношением процесса концентрирования за счет седиментации — флотации и процесса диффузии. Ширина полосы будет тем меньше, чем круче градиент плотности среды (dp/dr) и чем больше масса частиц: с увеличением массы уменьшается их склонность к диффузии. Распределение концентрации вещества в полосе описывается сим-
Рис. 62. Гауссова кривая распределения плотности в полосе препарата при равновесном центрифугировании (см. текст)
метричной гауссовской кривой (рис. 62). Ее основной параметр — полуширина полосы (а), которую определяют на высоте, соответствующей 0,607 от максимального значения концентрации в середине полосы (с0). Математическое выражение гауссовской кривой имеет следующий вид:
20
с — с0е
где е — основание натуральных логарифмов. При г—г* (см. рис. 6) получим: c=cj^e.
Теория показывает, что полуширина полосы а связана с массой сольватированной частицы М, плотностью р0, крутизной градиента в центре полосы dp0/dr, угловой скоростью вращения со, расстоянием от центра .полосы до оси вращения г0 и абсолютной температурой раствора (7) следующей зависимостью:
а2 — *Гро
М (dp0/dr) а>%
где R — универсальная газовая постоянная.
Из этого соотношения, зная условия центрифугирования (<о, Г), положение центра полосы (г0) и параметры градиента в нем (р0, dpo/dr), по полуширине полосы можно определить массу частицы. Следует иметь в виду, что при этом опеделяют массу сольватированной частицы, т. е. молекулы с присоединенной к ней водой, масса которой в иных случаях может быть соизмерима с собственной массой частицы.
Для предварительной оценки возможности регистрации полосы полезно указать, что концентрация вещества в центре полосы с0 связана с первоначальной концентрацией его (с) при исходном равномерном распределении во всем объеме простым соотношением: с0 = 0,4 Lc/o, где L — длина пробирки.
Ширина полосы 2о фигурирует в оценке разрешения двух близко расположенных полос. Оно может считаться надежным, если расстояние между вершинами соседних пиков вдвое больше их ширины, т. е. превышает 4а. Из этого не следует, что разрешение полос улучшается с увеличением крутизны градиента dpo/dr. Полосы действительно становятся уже, но при этом и сближаются, что увеличивает опасность их смешивания при «раскапывании» градиента.
СПОСОБЫ ОБРАЗОВАНИЯ И ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГРАДИЕНТОВ ПЛОТНОСТИ
Из приведенных в предыдущей главе данных следует, что сахароза и глицерин непригодны для создания необходимого в этом случае градиента. Плавучая плотность нуклеиновых кислот выше, чем самых концентрированных растворов сахарозы
и глицерина. Для белков могут быть найдены варианты, отвечающие нужному соотношению плотностей, но лишь с использованием очень плотных и вязких растворов сахарозы. Вряд ли имеет смысл искать другие органические соединения, пригодные для этой цели. Необходимость их высокой концентрации для обеспечения большой плотности требует очень хорошей растворимости в воде, а это означает высокое содержание карбонильных и гидроксильных групп, т. е. наличие сильных межмолекулярных водородных связей и, следовательно, большую вязкость раствора.
Предыдущая << 1 .. 103 104 105 106 107 108 < 109 > 110 111 112 113 114 115 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed