Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Пр и мер 6. Очистка поли(А)-РНК [Mansson et al., 1979]. Предполагаемая константа седиментации для поли(А)-РНК — около 10S. В качестве маркера для уточнения этой величины выбрали рибосомальную 18S РНК. В первом варианте авторы использовали градиент 5—20% сахарозы и 0,01 М Трис-НС1 (pH 7,6) с 5 мМ ЭДТА и 1% ДДС-Na (последнее — во избежание агрегации), ротор SW41Ti, ускорение 176 000 g, продолжи-
Агво
рования полисом печени крысы центрифугированием в градиенте плотности раствора саха-
Рис. 60: Профиль фрак'циони- .
Фракционирование РНК
тельность центрифугирования 22 ч при 20°. Для оценки выбора этих условий с помощью номограммы придется сначала по центробежному ускорению определить частоту вращения ротора. Ускорение принято указывать по дну пробирки. Максимальное значение центробежного ускорения при частоте 41 тыс. об/мин для ротора SW41Ti равно 286 ООО g (из фирменного описания). Отношение скоростей вращения равно квадратному корню из отношения центробежных ускорений. Отсюда следует, что авторы использовали ротор при частоте вращения 32 тыс. об/мин (JV=4iy 176/286). Следовательно, для указанных в работе условий опыта и s20,m = 10S 2 =s2o,MW210_5= 10-22-322-10-s = 2,25. Из графика (см. рис. 59) для градиента 5—20% при 20° и р= = 1,5 находим, что jc/L=0,66. Это вполне приемлемая точка градиента, и положение пика ria приведенном в работе профиле отвечает расчету. Однако маркер (18S РНК) при этом практически окажется на дне пробирки.
Во втором варианте авторы использовали более широкий (и крутой) интервал концентраций сахарозы (5—25%) и растворяли ее в буфере на основе 70%-ного раствора деионизированного формамида («денатурирующий градиент»). При тех же значениях частоты вращения ротора и температуры центрифугирование пришлось вести 54 ч (вместо 22 ч). Поли (А)-РНК оказалась в середине пробирки, зат® оба маркера (5S и 18S РНК) хорошо видны на градиенте. Использование формамида для полного «разворачивания» всех молекул РНК (полной денатурации) «повышает точность определения s20,ш с помощью маркерных РНК, однако за это приходится «расплачиваться» чуть ли не трехкратным увеличением продолжительности центрифугирования ввиду значительного увеличения плотности и вязкости среды.
Чистый формамид при 20° имеет вязкость (г|) 3,76 сП и плотность (р) 1,334 г/см3. В первом приближении можно считать, что эти значения для водных растворов формамида изменяются" (от г| = 1 и р=1 для воды) пропорционально его концентрации. Для 70%-ного раствора формамида в воде можно ориентировочно считать г]=2,92 сП, а р= 1,234 г/см3. Если сопоставить эти значения с табличными данными для водных растворов сахарозы, можно видеть, что такую же вязкость имеет 29%-ный раствор сахарозы, а плотность — д'аже 50%-ный раствор. Между тем в данном случае вязкость и плотность раствора формамида накладываются на аналогичные параметры раствора сахарозы. Этот градиент по-прежнему необходим для предотвращения конвекции и замедления оседания тяжелых частиц. Данные для более точной характеристики растворов сахарозы в водных растворах формамида отсутствуют, но рассмотренные результаты (увеличение времени центрифугирования в 3 раза для 70%-ного раствора формамида) могут служить отправной точкой при эмпирическом подборе оптимальных условий центрифугирования.
В качестве другого денатурирующего агента используют диметилсульфоксид .(ДМСО). В чистом виде он также обладает повышенной вязкостью и плотностью по сравнению с водой (при 20° г] = 2,473 сП, а р = 1,1 г/см3), однако этот прирост не столь велик, как при использовании формамида, поэтому иногда используют градиент сахарозы, растворенной в 99%-ном ДМСО. Так, в одной из работ [Harpold et al., 1979] было проведено фракционирование РНК в градиенте 5—20% сахарозы, растворенной в 99%-ном ДМСО (1% использовали для внесения Триса и ЭДТА). Центрифугирование в роторе SW27 при максимальном числе оборотов и температуре 29° заняло 70 ч. Фракционирование РНК в аналогичном градиенте сахарозы, но растворенной в 50%-ном водном растворе ДМСО, заняло 24 ч при частоте вращения ротора (SW40Ti) 40 тыс. об/мин и температуре 20°.
Таким образом, следует иметь в виду, что введение высоких концентраций денатурирующих агентов (формамида и ДМСО) заставляет увеличить продолжительность центрифугирования в 2—4 раза.
Фракционирование ДНК
Нативную ДНК можно фракционировать или очищать в нейтральном градиенте сахарозы, растворяя ее в 0,01 М трисовом или фосфатном буфере, содержащем 0,1—0,15 М NaCl 1 мМ ЭДТА и 0,1% саркозила. Последний необходим для уменьшения сорбции ДНК на стенках пробирки.
Пример 7. Фракционирование ДНК после осторожного фенолом в присутствии дезоксихолата (ДОХ) с последующей выделения из клеток L 1210 {Kiper et al., 1979]. ДНК выделяли экстракцией из интерфазы парааминосалициловой кислотой с 0,5 М NaCl без осаждения этанолом. Такая обработка позволила получать ДНК с константами седиментации 13—60S.
Фракционирование вели в градиенте 5—20% сахарозы при 38 тыс. об/мин (ротор SW40Ti) и комнатной температуре в течение 3,25 ч. Проверка распределения по градиенту с помощью номограмм при р=1,4 г/см3 и 20° дает для крайних значений указанного диапазона s2o,<» значения x/L, равные 0,18 и 0,85 соответственно.
