Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
В первом приближении эти же номограммы можно использовать для оценки неизвестной величины s20)W по положению частицы на градиенте в результате центрифугирования. Это положение позволяет определить по номограмме значение парамет-
15-30 % сахарозы
~~ г \ ; ------- ----- !
I [
I
i i i ' /
i ! J 4
; i i / /
i j +
1 * 1 _/ J
: i i
, / / / /
! f S Л /
|
i // \>
1 f 4 \
1
---.--1 ь //' \
i // г *¦
• /
... J' \ И
J У
& Г
Рнс. 59 (продолжение)
230
f
pa E, а поскольку время центрифугирования t и скорость вращения N известны, то из той же зависимости легко найти, что
_ 10*2
Sjo-w_
Здесь t измеряют в часах, N — в тысячах оборотов в минуту.
Можно, наоборот, предсказать положение на градиенте частицы с известной константой s20,w после центрифугирования в определенных условиях. Для этого достаточно рассчитать величину S = s!0iWWa> 10-5 и с помощью соответствующего графика определить конечное положение частицы (x/L).
Для более точного определения s20,w, как уже указывалось, следует воспользоваться истинно изокинетическим или почти изо-кинетическим (линейным с интервалом концентрации в 15%) градиентом и одним или двумя «маркерами».
Можно построить номограммы, подобные приведенным, но более точные, для определения s20,w без маркера, по положению частиц в результате центрифугирования в линейном градиенте сахарозы. В этом случае их следует строить отдельно для каждого ротора и наперед условиться о заполнении полусферического дна пробирки «подушкой» определенного объема, не участвующей в формировании градиента плотности раствора сахарозы. Сам градиент тоже должен иметь строго определенный объем. Все эти ограничения не слишком обременительны, но не следует забывать, что при «раскапывании» градиента точность определения положения пиков соответствующих зон не очень высока, так что определение значений si0,w с точностью, превышающей ±5%. вряд ли реально.
НЕКОТОРЫЕ ПРИМЕРЫ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ В ГРАДИЕНТАХ САХАРОЗЫ
С помощью предложенных выше подходов проанализируем несколько описанных в литературе примеров использования зонально-скоростного центрифугирования в градиентах сахарозы с точки зрения выбора режима. Одновременно составим представление о порядках значений скорости и продолжительности центрифугирования в наиболее типичных случаях фракционирования белков и нуклеиновых кислот. Примем следующие приблизительные значения плавучей плотности (р, г/см3): для белков 1,3; для ДНП 1,35; для ДНК и РНП 1,4; для РНК 1,5.
Фракционирование рибонуклеопротеидов
Пример 1. Фракционирование мРНК информосом и полисом из мышцы зародыша цыпленка [Jain, Sarkar, 1979]. Использовали мРНП из обоих источников после очистки их на оли-го(дТ)-целлюлозе (р= 1,4 г/см3). Ожидаемый диапазон для
г»
Sso.w —от 10 до 90S—довольно велик. Чтобы весь он уложился на градиенте, авторы выбрали крутой градиент плотности сахарозы: 15—40%. Был использован ротор SW40Ti при 5° и частоте вращения 39 ООО об/мин.
Проведем сначала сами расчет времени центрифугирования, а затем сравним его с тем, которое использовали авторы. Для частиц с s20,w=90S выберем конечное положение на 0,8 длины градиента, т. е. x/L=0,8. Из соответствующего графика (рис. 59) находим, что 2=10,4. Тогда t= (105-10,4)/90• 392 = 7,6 ч. Для частиц с s20,w=10S E=s2o,w^210"4= 10*7,6-392-10_5= 1,15. Из того же графика находим, что наиболее легкие частицы (10 S) в этом случае к концу центрифугирования пройдут примерно 0,1 длины градиента,— это вполне приемлемо.
Авторы работы центрифугировали в течение 7 ч.
Пример 2. Фракционирование РНП из ядер печени лягушки [Maxwell, Fischer, 1979]. В работе использовали градиент сахарозы 10—30%, центрифугировали в роторе SW27.1 с частотой
26 000 об/мин при 2° в течение 9 ч. Посмотрим, где должны оказаться в конце центрифугирования частицы с константами седиментации 10 S и 90 S.
Для s20w=90 S найдем, что 2=90*9‘ 262-10_5=5,4. В приведенных номограммах нет кривых, отвечающих градиенту 10— 30%. Для приблизительной оценки проведем на графике (см. рис. 59) кривую, идущую ниже, чем кривая для градиента 10— 35% (5°; р=1,4), но выше, чем соответствующая кривая для 10—25% сахарозы. Эта грубая интерполяция позволит найти относительное положение 90S частиц на градиенте: x/L — 0,7. Заметим, что, свободно варьируя построение этой вспомогательной кривой в этих пределах, мы не сможем значительно удалиться от найденного значения x/L. Это видно и из того, что для градиента 10—35% и 2=5,4 мы определили бы x/L — 0,64, а для градиента 10—25% x/L=0,75. Отсюда следует, что для качественной оценки ситуации точность предлагаемого графического метода вполне достаточна.
