Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика иммуноферментного анализа" -> 96

Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилов Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaipraktika1999.djvu
Предыдущая << 1 .. 90 91 92 93 94 95 < 96 > 97 98 99 100 101 102 .. 123 >> Следующая

ду константами связывания меченого (К*) и определяемого (К) антигенов. Для этого следует выбирать соотношение концентраций компонентов, соответствующее условиям (9.14). Иллюстрация этого положения приведена на рис. 31.
Рис. 31. Теоретические калибровочные графики при отсутствии в системе неспецифического связывания (начальные условия; [Ат]о=0,3 нМ; К— = 10» М—¦: 1 — [Аг*]о=0,5 нМ; К*=
= 109 М-1; 2 — [Аг*]о=4 нМ; К*=10« М-1; 3 — [Аг*1о=0,03 нМ; К* =-ЮЮ М-1)
Рис. 32. Теоретическая иллюстрация изменения положения калибровочного графика при снижении константы связывания меченого антигена и наличии в системе низкоаффинных центров неспецифического связывания (или низкоаффинной фракции антител) :
[Аг*]„=1 нМ; [Ат,1о=0,3 нМ; К, = 109 м-1; [Атг]о=2,7 нМ; К2=107 М-1; / — К* =
= 109 М-1; 2 — К*=10? М-1; [Ат,]„ и
]Ат2]о — концентрация высоко- н ннзкоаф-фннных центров связывания антнтел
В реальных системах, в которых имеются центры специфического и неспецифического связывания, снижение константы связывания меченого антигена может приводить к возрастанию вклада неспецифических вазимодействий, проявляющегося в изменении положения калибровочного графика (рис. 32). Поэтому уменьшение способности антигена к связыванию с антителами вследствие введения ферментной метки крайне нежелательно.
После рассмотрения общих закономерностей конкурентного анализа проиллюстрируем теоретическими графиками влияние констант связывания и концентраций реагентов на положение калибровочных кривых (рис. 33), построенных путем решения уравнений (9.3) — (9.5) на ЭВМ.
Сравнение графиков показывает, что чувствительность определения антигена зависит от константы связывания и улучшается с ее увеличением. За параметр, характеризующий возможность измерения данной концентрации антигена, удобно принимать отношение равновесных концентраций связавшегося с антителами меченого антигена в отсутствие и в присутствии определяемого антигена (В*/[АтАг*]). Близкие к единице значения этого параметра
Рнс. 33. Теоретические калибровочные графики при разных значениях константы связывания реакции антиген — антитело:
[Аг*]о=0,4 нМ; [Ат]о=*0,!2 нМ: значения
К~К* и для кривых 1 — 4 соответственно равны 106, 10», ЮЮ, Ю12 м-1
Рнс. 34. Изменение теоретических калибровочных зависимостей в конкурентном .методе прн ' варьировании начальной концентрации антител: ([Аг*]о=0,4 нМ; /(=/(* = 10» М->): для
кривых 1 — 4 [Ат] ¦ Ю8 соответственно равна 0,6; 1^5; 2,5; 5,0 М
указывают на то, что достоверное измерение антигена маловероятно. Однако реальный предел возможности определения может быть установлен только с учетом ошибки метода регистрации ферментативной активности. Однако, как видно из графиков, площадь, которая заключена между соседними кривыми, уменьшается с ростом констант связывания. Нетрудно убедиться, что при фиксированной концентрации меченого антигена существует предельное значение константы связывания, превышение которого сопровождается минимальным дальнейшим увеличением чувствительности. Этот эффект будет проявляться при близкой к 100% степени насыщения центров связывания, антител меченым антигеном в отсутствие определяемого антигена. Так, кривая 4 (рис. 34)
(степень насыщения антител 99%) при увеличении константы связывания до 1013 М-1 и выше не изменяет своего положения. Дальнейшее увеличение чувствительности может быть достигнуто только снижением начальной концентрации меченого антигена, которое ограничено чувствительностью регистрации метки.
Теоретические калибровочные графики при различных концентрациях антител приведены на рис. 34. Как следует из проведенного математического анализа, максимальная чувствительность (кривая 1) наблюдается при концентрациях антител, не превышающих значений констант диссоциации комплекса антиген — антитело.
# Возможность использования для анализа больших или меньших количеств меченого антигена определяется степенью сохранения ферментом каталитической активности после ковалентного связывания и чувствительностью регистрации продуктов ферментативной реакции. Из данных (рис. 35) следует, что при /С=108 М-1 варьирование концентрации меченого антигена иа два порядка при практически неизменной Рнс 35 Влнянне йачальной кон. концентрации антител не влияет на центрацнн меченого антигена и положение калибровочного графика, констант связывания на инжннй Что обусловлено НИЗКОЙ степенью предел обнаружения антигена в насыщения центров связывания. Это конкУРентном “ет°де:
а,ля кривых 1, 2 л=л*=Ю5 М-1;
означает, что при константах связы-[Аг,]о=44 и 044 нМ. для кривых 3_
вания 108 М-1 И ниже уменьшение 4, 5 /С=/С* = 10“> М-'; [Аг*]0=4,4; 0,44;
концентрации ферментной метки за0,04 нМ соответственно; по оси ординат
* т г отложена величина связывания мече-
счет увеличения активности фермен- ного антигена в % та не должно приводить к изменению нижнего предела обнаружения антигена.
• При увеличении константы связывания до 1010 М-1 наблюдается уменьшение нижнего предела детекции при снижении концентрации меченого антигена. Теоретически при возможности бесконечного уменьшения концентрации ферментной метки и антител и бесконечного увеличения константы связывания чувствительность определения антигена не имеет нижнего предела. На практике такое условие, естественно, невыполнимо, что приводит к ограничению чувствительности анализа.
Предыдущая << 1 .. 90 91 92 93 94 95 < 96 > 97 98 99 100 101 102 .. 123 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed