Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика иммуноферментного анализа" -> 94

Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилов Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaipraktika1999.djvu
Предыдущая << 1 .. 88 89 90 91 92 93 < 94 > 95 96 97 98 99 100 .. 123 >> Следующая

Модель, основанная на этих допущениях, конечно, не отражает всех свойств реальной системы, но дает возможность оценки влияния ряда параметров на результаты анализа.
В соответствии с принятыми условиями распределение компонентой в ходе анализа может быть представлено следующей ; схемой:
(9.1)
(9.2)
Ат-J-Ar^t АтАг Ат4-Аг*:?АтАг*
которая при равновесии описывается системой уравнений: [Ат]0=[Ат] + /ПАт][Аг] + /<*[Ат][Аг*] (9.3)
[Аг*]==[Аг*]+-ЛГ [Ат] [Аг*1 [ Аг1о=1Аг] +ЛГI Ат] [ Аг]
(9.4)
(9.5)
где [Ат], [Аг] и [Аг*]—равновесные молярные концентрации соответственно антител, определяемого и меченого антигенов; [АтАг] и [АтАг*] —равновесные концентрации специфических комплексов антиген — антитело; [Ат]0, [Аг]о и [Аг*]0 — начальные концентрации компонентов; К и К.*— константы связывания антител с определяемым и меченым антигенами.
Если ферментом помечен высокоочищенный антиген, то на заключительной стадии анализа возможно измерение как несвязанного с антителами Аг*, так и связанного (АтАг*) меченого антигена. В первом случае процедура твердофазного анализа упрощается, так как не требуется отмывка иммуносорбента, предшествующая измерению метки. Если метка вводится в неполностью очищенный препарат антигена, то определение ее ферментативной активности возможно в комплексе АтАг* только после его отделения, так как в несвязанном с антителами состоянии в этом случае кроме меченого антигена находятся и меченые примесные компоненты. \
В ходе анализа антиген образует комплекс со специфическими антителами. Если бы образовавшийся комплекс или оставшиеся свободными центры связывания антител могли регистрироваться непосредственно, то анализ мог бы проводиться без участия меченого антигена. Но в настоящее время регистрация этого процесса при крайне низких концентрациях компонентов весьма затруднительна. Поэтому использование меченых соединений является высокочувствительным средством «визуализации» образовавшегося комплекса антитело — антиген. В рассматриваемом случае определяемый и меченый антиген вводятся одновременно и конкурируют за центры связывания антител.
Об образовании комплекса антитела с определяемым антигеном свидетельствует изменение концентрации свободных центров связывания, доступных для взаимодействия с меченым антигеном, которое и регистрируется в ходе анализа. В рамках введенных нами обозначений концентрация комплекса [АтАг*] убывает с ростом концентрации антигена, а концентрация [Аг*] возрастает.
Проанализируем схему, считая, что в ходе анализа определяется концентрация метки в комплексе с антителами [АтАг*].Тогда калибровочный график соответствует зависимости [АтАг*] = =/([Аг]0) и при арифметическом масштабе абсциссы имеет гиперболический вкд, как на рис. 31. Каково предельное положение этой кривой, соответствующее условию достижения минимально детектируемой концентрации антигена? Мысленно представим, что
с одинаковыми реагентами и в одинаковых условиях получают два калибровочных графика — без и с использованием меченого антигена. Первый график фактически является кривой титрования активных центров антител антигеном и описывается зависимостью [Ат]=/([Аг]о), где [Ат] — концентрация свободных активных центров антител) по форме, совпадающей с зависимостью для второго графика [АтАг*] =/ (Аго). Кривая титрования и является тем пределом, к которому должен стремиться реальный калибровочный график при необходимости достижения предельно возможной чувствительности. При оптимизации метода сравнение соответствия теоретической кривой титрования и калибровочной кривой целесообразно проводить в нормированных координатах, в которых масштаб ординат для разных зависимостей выбирается таким образом, что их амплитуды на графике совпадают.
Теоретически при соблюдении условия [АтАг*] =J?[At] (R — коэффициент пропорциональности), т. е. при наличии строгой пропорциональности между концентрациями связанного меченого антигена и свободными активными центрами антител, оба графика в нормированных координатах должны совпадать. На практике, в силу различных причин, пропорциональность может значительно нарушаться. В связи с этим задачей оптимизации метода является выбор условий, приводящих к максимальному соответствию калибровочной кривой и кривой титрования. Проведем оценку этих условий, учитывая введенные ранее допущения. Выразив [Ат]
из уравнения (9.3), перепишем уравнения (9.3) — (9.5) в виде
[Аг]0=[Аг]+----------------------; (9.6)
1 10 1 ]+ЛГ[Аг]+/(*[Аг*] ' '
[Дг*7—ГАг*1 I *С* [Ат]о [Аг*]
Jo-LAr ]+ 1+К[Аг]^КЧКгП -
Вычислив из (9.7) значение [Аг], подставив его в (9.6) и заменив [Аг*]0—[Аг*] на [АтАг*], получим в неявном виде зависимость концентрации связанного с антителами меченого антигена от начальной концентрации определяемого антигена:
Предыдущая << 1 .. 88 89 90 91 92 93 < 94 > 95 96 97 98 99 100 .. 123 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed