Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 30. Калибровочный график определения антигена:
по осн абсцисс — начальная концентрация антигена [Аг]0; по осн ординат — концентрация комплекса антител с меченым антигеном; [Arl0.min — минимально определяемая концентрация антигена, соответствует уменьшению концентрации связанного меченого соединения прн отсутствии в системе определяемого антигена (В* прн Аг0=0) на величину, превышающую ошибку ее измерения (S*B*)
Таким образом, экспериментально нижиий предел обнаружения может быть установлен только на основе построения доверительных интервалов для «фоновой» и начальных точек калибровочного графика, при этом каждая точка должна дублироваться статистически достоверное число раз. Ширина доверительного интервала зависит от разброса показаний в параллельных пробах; поэтому высокая чувствительность при плохой воспроизводимости результатов достигнута быть в принципе не может.
Следовательно, предел обнаружения или чувствительность ИФА определяется физико-химическими параметрами иммунологических и ферментативных реакций, соотношением компонентов и ошибками при измерении параллельных проб на начальном участке калибровочного графика.
Точность анализа. Это параметр, с помощью которого устанавливают различия между параллельными (или последовательными) результатами анализа одной и той же пробы. Количественно точность характеризуется коэффициентом вариации, представляющим стандартное отклонение, выраженное в процентах от среднего значения. На точность анализа влияют многие факторы, в первую очередь постоянные и случайные ошибки, возникающие в ходе анализа, качество регистрирующей аппаратуры, квалификация персонала. Подробный анализ этих факторов дан в книге «Радиоимму-нологические методы» (Чард, 1980), которая может быть рекомендована всем желающим более детально ознакомиться с этим вопросом.
Среди известных биологических соединений антитела обладают уникальными свойствами распознавать антиген, против которого они получены. Но это не означает, что антитела способны связываться только с ним. Используемые в анализе антитела могут взаимодействовать с компонентами исследуемой пробы, которые близки по структуре, с антигеном или даже несут одинаковые антигенные детерминанты. В связи с этим одной из характеристик иммунохимического анализа являете^- специфичность, отражающая степень достоверности выявления анализируемого jвещества по сравнению с другими компонентами пробы. Качественно специфичность может быть охарактеризована при изучении перекрестных реакций с близкими по структуре антигенами.
При проведении конкурентного анализа перекрестно реагирующее соединение будет, подобно антигену, препятствовать связыванию с антителами меченого антигена. .Один из путей оценки специфичности сводится к построению калибровочных кривые для антигена (А) и перекрестно реагирующего соединения (Б) отдельно. Если 50%-ное (или любое другое) ингибирование связывания меченого антигена достигалось при концентрации А, допустим, 10 ед/мл, а в случае Б— 100 ед/мл, то при параллельности калибровочных кривых можно считать, что перекрестная реакция с Б составляет 10%- Влияние перекрестно реагирующих соедине-
ний на ход анализа необходимо оценивать, исходя из их содержания в анализируемом образце. Допустим, в связи с данной чувствительностью метода необходимо анализировать пробу в разведении, обеспечивающем содержание А в концентрации 10 ед/мл. Если Б при этом также находится в концентрации 10 ед/мл, то его присутствие практически не отразится на результатах анализа. Если же Б находится в коцентрации 1000 ед/мл, то достоверное определение А на его фоне невозможно.
Время проведения. Длительность ИФА при наличии готовых реагентов и методики складывается из времени, затрачиваемого на реакцию антиген — антитело, промывку и дозировку компонентов, а также времени проведения и регистрации ферментативной реакции. При осуществлении твердофазного ИФА лимитирующей по времени стадией является доведение реакции антиген — антитело до равновесного состояния. Так как взаимодействие антитела с антигеном формально представляет обратимую реакцию второго порядка, то время приближения к равновесию возрастает с уменьшением концентрации определяемого антигена. Фактором, определяющим время достижения равновесия, является константа скорости образования комплекса антиген — антитело.
§ 1. Теоретические закономерности конкурентного иммуноферментного анализа
Принцип конкурентного ИФА состоит в одновременном добавлении определяемого и меченного ферментом антигена к антителам, доведения системы до равновесия и последующего измерения ферментной метки в комплексе с антителами или в несвязанном меченом антигене.
• Проанализируем некоторые закономерности конкурентного анализа, исходя из следующих допущений: 1) образование комплекса антиген — антитело происходит в соотношении 1:1; 2) все молекулы антител обладают одинаковым сродством к антигену; 3) меченный ферментом и определяемый антигеи взаимодействуют с антителами с разными константами связывания; 4) измерение ферментативной активности проводится после установления в системе равновесия.
