Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
В ИФА стабильность антитела определяется интервалом времени, в течение которого остается постоянной их способность связывать антиген. В иммуноферментных наборах, укомплектованных готовыми иммуносорбентами, период стабильности антител явля-
* Необходимо следить за тем, чтобы элюируемые с колонки антитела быстро переводились в раствор с нейтральным значением pH,
pH 4,0
10 20 30 W 50 60 Окем элюата, ил
ется одним из основных параметров, определяющих срок годности диагностикума.
При правильном соблюдении условий хранения иммобилизованные антитела стабильны в течение достаточно длительного периода времени. Адсорбированные на полистирольных планшетах или пробирках препараты могут храниться до применения при +4°С более года. Обязательным условием является отсутствие влаги, для чего после иммобилизации необходимо тщательно высушить препарат при комнатной температуре, а затем хранить его в герметически закрытой таре в присутствии осушителя. При комнатной температуре адсорбированные антитела стабильны в течение 1,5—2 мес, что дает возможность осуществлять транспортировку готовых наборов на большие расстояния.
Стабильность иммобилизованных антител при хранении в растворе, как правило, менее высокая, что связаио со смыванием белка с носителя, действием микрофлоры и т. д. Срок хранения составляет в большинстве случаев несколько месяцев.
Стабильность антител в значительной степени определяется свойствами поверхности носителя, что необходимо учитывать при выборе твердой фазы в ИФА.
iV'1'11 -------- ..vmji
Ag + Ab K1 ^K2 Ag : Ab;
.ЛЙ
Теоретические
основы
иммуноферментного
анализа
В данной главе будут рассмотрены основные количественные закономерности четырех наиболее распространенных в ЙФА схем: конкурентной, метода последовательного насыщения, «сэндвич»-метода и метода определения антигенов с использованием меченых антивидовых антител.
Прежде всего дадим краткую характеристику некоторых часто используемых в анализе понятий: предел обнаружения, длительность, точность и специфичность. В зависимости от задач разрабатываемого анализа эти параметры могут варьироваться в достаточно широких пределах. Как и все иммунохимические методы, ИФА основан на реакции взаимодействия антиген — антитело, закономерности которой в значительной степени обусловливают возможность достижения необходимых значений перечисленных параметров. Каждая схема ИФА представляет определенную комбинацию иммунологических реакций, проходящих одновременно или последовательно. В связи с этим различные методы ИФА имеют свои особенности и в большинстве случаев описываются разными уравнениями. В этом разделе сначала будут кратко даиы сведения об основных характеристиках ИФА, а затем более детально рассмотрены закономерности нескольких наиболее широко используемых схем анализа. Основное Bi.aMdiiHe при этом будет уделено закономерностям иммунохимических стадий анализа, что представляет интерес как для
ИФА, так и других иммунологических методов, основанных на использовании меченых соединений.
Предел обнаружения. Под пределом обнаружения в ИФА следует поницать минимальную достоверно определяемую концентрацию исследуемого вещества. Часто в литературе под этим термином подразумевают чувствительность анализа. При представлении экспериментальных данных наиболее корректно выражать эту величину в концентрационных единицах (моль/л, нг/мл и т. д.). Часто встречающееся выражение в Массовых единицах (например, «метод позволяет определить 1 пмоль белка», или «0,1 нг белка в пробе») затрудняет реальную оценку этого параметра, а в отсутствие указаний конечного объема анализируемой смеси де-ляет это невозможным.
При проведении ИФА можно выделить два этапа. Первый — перераспределение компонентов реакционной смеси в ходе имму-нохимических реакций, число и последовательность которых определяется выбранной схемой. Второй — выявление меченого соединения при проведении ферментативной реакции. Оба этапа влияют на предел обнаружения анализируемого соединения, который зависит от константы связывания используемых антител, соотношения концентраций при анализе и условий проведения реакции (температура, pH, концентрация детергента, природа буфера и т. д.). Чувствительность на втором этапе определяется активностью фермента и чувствительностью метода детекции продуктов ферментативной реакции.
Мы определили чувствительность как минимальную концентрацию, достоверно регистрируемую в данном анализе. Под термином «достоверно» подразумевается то, что параметр ферментной реакции (начальная скорость реакции, оптическая плотность продукта за фиксированный промежуток времени и т. д.), регистрируемый в присутствии «минимальной» концентрации анализируемого соединения, превышает параметр «фоновой» реакции (т. е. реакции в отсутствие антигена) на величину, большую, чем ошибка измерения (рис. 30).
