Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
гидом Аффинный (2,6±0,4) • 10-11 моль/мг
2. Сефароза 4В, активирован Адсорбционный (2,8±0,5) • 10~и моль/мг
ная BrCN (0,2±0,1) • 10~12 моль/см2
3. Сефароза с иммобилизо
ванным IgG
4. Лунка планшета из про
зрачного полистирола
Константа связывания антигена с иммобилизованными антителами. Степень сродства антител к антигену, количественно выраженная константой связывания, является основным параметром, определяющим чувствительность иммунохимического анализа. Процедура иммобилизации в ряде случаев может приводить к снижению константы связывания, что является одной из отрицательных сторон твердофазного анализа. Так, при сравнительном изучении антител к инсулину показано, что константа связывания антигена с иммобилизованными антителами в 20 раз ниже, чем в растворе. Экспериментально значения констант связывания получают из опытов по титрованию активных центров антител (рис. 28).
Антитела, вырабатываемые организмом против антигенных детерминант, представляют неоднородную популяцию. Поэтому в случае поликлональных антител определяемое значение константы связывания является эффективной величиной, характеризующей образование иммунного комплекса с антителами, активные центры которых обладают различным сродством к антигену (см. гл. 2, § 2, 4). В связи с этим данные титрования в координатах (B/F-f-4-В), как правило, представляют криволинейную зависимость, которую можно аппроксимировать двумя прямыми (рис. 28, б), вы-
делив из гетерогенной смеси антител две популяции, средние значения констант связывания антигена которых значительно отличаются.
Концентрация фракции антител с высоким эффективным значением константы связывания, как правило, значительно ниже, чем с низким. Для разработки суперчувствительных систем детекции бывает необходимо выделять наиболее высокоаффинную фракцию и использовать в анализе только ее. Это может достигаться путем адсорбции антител на иммобилизованном антигене и последующей их элюцией линейным или ступенчатым градиентом pH, что
Рис. 28. Титрование активных центров иммобилизованных антител против IgG-человека конъюгатом IgG — ПХ (а) и представление результатов в координатах Скэтчарда (б):
а — по оси ординат — оптическая плотность А при А.“490 им продукта пероксндазной реакции окисления о-фенилендиамина перекисью водорода, соответствующая количеству ак-тнвиых центров на носителе; по оси абсцнсс — концентрация конъюгата в растворе
обеспечивает последовательное смывание с колонки молекул по мере увеличения их сродства к антигену. Последними при наиболее кислых значениях pH элюируются антитела, обладающие максимальным значением константы связывания. Ниже приведена одна из возможных методик на примере фракционирования антител против инсулина.
Методика. .
Сорбент получают на основе активированной бромцианом сефарозы 4В, С которой связывают инсулин ковалентно. К 2 г активированного носителя добавляю! 50 мг инсулина в 30 мл буфера 0,1 М NaHC03 (pH 8,3), содержащего 0,5 М NaCl. Инкубируют при осторожном перемешивании. Контроль за связыванием белка осуществляют спектрофотометрически при Л=280 нм. После окончания связывания отмывают сорбент тем же буфером. Сорбцию антител сорбентом осуществляют в проточной замкнутой системе, состоящей из колонки с сорбентом (0,4X5) см, перистальтического иасоса, увикорда и пробирки с раствором IgG-фракции антисыворотки. На колонку с 1 мл сорбента с пришитым инсулином наносят 60 мг IgG-фракции и выдерживают 2 ч. Затем удаляют избыток белка и промывают колонку 45 мин 0,05 М фосфатным буфером (pH 7,3), содержащим 0,1 М NaCl,.За полнотой отмывки следят по показаниям увикорда,
Элюцию антител проводят с использованием ступенчатого градиента в интервале pH от 4 до 2. Градиент pH создают смешением двух буферных растворов: 1—0,2 М К2НРО4 — лимонная кислота (pH 4,0); 2 — 0,2 М раствор лимонной кислоты. Условия элюции: время градиента 4 ч, скорость элюдии
0,2 мл/мин, число ступеней градиента 6*.
При данных условиях с колонки элюируется несколько фракций антител (рис. 29) с разными значениями констант связывания инсулина (численные значения констант определены гомогенным методом биолюминесцентного иммуно-кофакторного анализа с использованием инсулина, меченного АТР). Значениям pH элюции 3,8; 3.3; 2,5; 2,2; 2 соответствовали фракции с константами связывания 10-6; 3-10-7; 8-10-8; 3-10-*° М,
Рис. 29. Профиль элюции антител против инсулина с нммуносорбента на основе сефарозы-4В ступенчатым градиентом pH 4,0—2,0
(время элюции 4 ч; скорость элюции 0,25 мл/мин)
Стабильность иммобилизованных антител при хранении. Постоянство концентрации и сродства иммобилизованных антител является необходимым условием для получения воспроизводимых результатов твердофазного ИФА. Изменение этих характеристик может происходить за счет десорбции или разрыва химической связи антител с носителем и денатурации связанного белка. Экспериментально изменение концентрации или свойств иммобилизованных антител проявляется в уменьшении степени связывания в стандартных условиях' фиксированной концентрации меченого антигена.
