Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика иммуноферментного анализа" -> 90

Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилов Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaipraktika1999.djvu
Предыдущая << 1 .. 84 85 86 87 88 89 < 90 > 91 92 93 94 95 96 .. 123 >> Следующая

Концентрация иммобилизованных антител. Эта величина является одним из основных параметров, варьированием которого можно оптимизировать чувствительность и длительность анализа. Для успешной разработки метода ИФА знание точного значения этой концентрации необязательно. В большинстве случаев экспериментатор оперирует понятиями «количество, или концентрация иммуносорбента» (при использовании гранулированных носителей) или «концентрация белка при адсорбции» (для непористых полимерных материалов). Точное знание концентрации необходимо в тех случаях, когда ставится задача изучения физико-химических характеристик взаимодействия антиген — антитело либо получения исходных данных для оптимизации схемы ИФА на ЭВМ.
Определение концентрации иммобилизованных антител методически довольно сложно. Чаще всего для связывания с носителем используют IgG-фракцию иммунной сыворотки, точное содержание антител в которой неизвестно. Поэтому простое определение концентрации связавшегося с носителем белка не дает нужной информации. При иммобилизации аффинно выделенных антител, определив убыль белка из исходного раствора в процессе связывания и учтя количество антител, десорбировавшихся в результате промывок сорбента, можно найти суммарное количество молекул, присоединившихся к носителю. В результате подобных экспериментов может быть установлена емкость носителя, т. е. количество молекул антител, которое при данном методе иМ-
мобилизации связывается с единицей массы или площади носителя (например, мг/г или мг/см2).
Однако в большинстве случаев интересуются не общим количеством связанных антител, а антителами, сохранившими способность к взаимодействию с антигеном после иммобилизации. Часть молекул антител Может утратить эту способность в результате присоединения к носителю антиген-связывающими центрами, сте-рического экранирования или других причин. Абсолютное число активных антител можно определить методом титрования активных центров антител антигеном. Существующие подходы позволяют проводить исследование с использованием как высоких, так и низких концентраций антигена и иммуносорбента. В первом случае иммуносорбент инкубируют с избытком антигена, затем диссоциируют специфический комплекс при pH 2—2,2 или раствором с высокой концентрацией солей (2—5 М) и определяют количество выделившегося антигена. Этот подход требует больших количеств сорбента и допускает возможность значительных ошибок вследствие смывания антител с носителя при экспериментальных значениях pH или ионной силы.
Значительно более прецизионный подход основан на титровании активных центров иммобилизованных антител меченым антигеном. В качестве метки целесообразно использовать низкомолекулярные соединения (изотоп, флуоресцирующий краситель, кофактор и т. д.), чтобы в максимальной степени снизить вероятность экранирования меткой антигенных детерминант. Суть метода заключается в насыщении микроколичеств иммуносорбента меченым антигеном. Получаемая в результате опыта изотерма адсорбции позволяет вычислять концентрацию и константы связывания иммобилизованных молекул антител. Так как'в подобном эксперименте определяется не абсолютная концентрация активных центров антител, а концентрация центров, доступных для взаимодействия с антигеном, следует ожидать, что эта величина будет различной для антигенов с разными размерами и молекулярной массой. Например, при иммобилизации антител разной специфичности часть центров может экранироваться носителем от контакта с макромолекулярным антигеном, но быть доступной для низкомолекулярного. л
В ИФА титрование активных центров антител часто проводят конъюгатом антиген — фермент, в котором часть детерминант может быть экранирована маркером. В этом случае следует учитывать, что из числа доступных активных центров определяется концентрация только тех, которые специфичны к неэкранировай-ным антигенным детерминантам конъюгата.
В табл. 8.1 приведены количества иммобилизованных антител против IgG человека, определенные методом титрования иммуносорбентов конъюгатом IgG—пероксидаза. Иммуносорбенты получены с использованием носителей и методов иммобилизации, ши-
роко применяемых в ИФА. Данные таблицы иллюстрируют значения концентраций доступных центров связывания, которые могут быть получены при ковалентной и аффинной иммобилизации антител на пористых носителях органической и неорганической природы и адсорбционном связывании с непористым полистиролом.
Для упрощения сравнения в .таблице приведена суммарная концентрация иммобилизованных антител без деления на концентрации центров, обладающих большим и меньшим сродством к антигену. На сорбентах 1—3 иммобилизована IgG-фракция антисыворотки; на сорбенте 4 — аффинно выделенные антитела.
Таблица 8.1
Носитель Метод Количество
иммобилизации иммобилизованных антител
1. Силохром G-20 мк, акти Ковалентный (9,2±1,8) ¦ 10_п моль/мг
вированный глутаровым альде » сухого сороента
Предыдущая << 1 .. 84 85 86 87 88 89 < 90 > 91 92 93 94 95 96 .. 123 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed