Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
После иммобилизации антител (антигена) часть центров сорбции носителя экранируется связанным белком и становится недоступным для взаимодействия с компонентами анализируемой пробы и ферментным конъюгатом. В связи с этим наиболее ценную для анализа информацию дает сравнение эффективности сорбции меченного пероксидазой инсулина на двух иммуносорбентах, один из которых содержит иммобилизованные специфические антитела, а другой — антитела неиммунизированного животного* (рис. 26). Подобный эксперимент позволяет учесть суммарное неспецифическое связывание с носителем и иммобилизованными иммуноглобулинами, но не дает возможность различить эти два эффекта.
Неспецифическое связывание меченого соединения в значительной степени обусловлено его концентрацией, концентрацией иммуносорбента и временем их контакта. Оптимальные соотношения этих факторов в каждом конкретном случае надо выбирать экспериментально. Однако очевидно, что уменьшение концентрации меченого соединения и проведение анализа в кинетическом режиме должно способствовать уменьшению неспецифического связывания. Реально возможность его снижения таким путем зависит от требуемой чувствительности анализа и соотношения -кон-стаит скоростей образования специфического и неспецифического комплексов.
Механизм неспецифических эффектов в ИФА в настоящее время изучен' далеко не полностью. Несмотря на существование перечисленных выше действенных путей подавления неспецифического связывания с иммуносорбентом, отнюдь не .всегда понятно, за счет чего достигнут требуемый эффект. В связи с этим оптимизация этого важного для анализа параметра чаще всего проводится. эмпирическим путем и подходы подавления неспецифического связывания, эффективные для одного объекта, не гарантируют аналогичных результатов при переходе к другому даже в том случае, когда в качестве твердой фазы применяется, один и тот же носитель.
* При этом желательно, чтобы животные были из одной популяции и содержались в одиих условиях,
Например, одна из широко реализуемых схем ИФА («сэндвич»-метод) основана на использовании иммобилизованных антител, которые связывают определяемый антиген, после чего он выявляется конъюгатом антител с ферментом. Этот метод можно применять в том случае, если в отсутствие антигена концентрация меченых антител, неспецифически связавшихся с иммуносорбентом,
значительно меньше, чем в его присутствии. С формальной точки зрения, при условии постоянства носителя, методов получения и концентраций реагентов, а также условий проведения анализа регистрируемый параметр «фоновой» реакции (иммобилизованные антитела + меченые антитела) для антител, специфичных к разным антигенам, должен быть одинаков. Реально эта величина колеблется в достаточно широких пределах, а в некоторых случаях аномально зависит от концентрации компонентов. Иллюстрирующие последнее положение зависимости приведены на рис. 27. Как видно из графика, уменьшение эффективности связывания меченых антител против инсулина наблюдается только при значительном уменьшении концентрации антител на фазе. Использование рекомендуемых обычно концентраций антител при адсорбции («5 мкг/мл) приводит к существенному увеличению регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной реакции, что делает невозможным чувствительное определение анализируемого антигена. Экспериментально подтверждающего объяснения подобного аномального «средства» иммобилизованных и меченых молекул антител пока не найдено. Не исключено, что в некоторых случаях данный эффект может быть связан с наличием в сыворотке антиидиотипических антител (антител к специфическим антителам), которые вместе с другими IgG метятся ферментом. Один из путей снижения неспецифического связывания конъюгата в «сэндвич»-методе—использование для адсорбции и метки антител разных видов животных.
• Выяснение механизма и поиск путей максимального (и универсального) снижения неспецифического связывания является одной из насущных задач ИФА, так как этот параметр в значительной степени определяет чувствительность анализа. Например,
Ат
Рис. 27. Взаимодействие меченных ПХ антител с комплексом антиген-поликлон&льные антитела, предварительно адсорбированные в различных концентрациях Ат на полисти-рольных планшетах для ИФА:
на носителе и в конъюгате против HBs — антигена (/)_ - и инсулина (2), 0,01 М. фосфатный буфер, содержащий 0,1 М NaCl и 0,1% тритона Х-100, pH 7,4
теоретическая чувствительность «сэндвич»-метода, без учета неспецифических взаимодействий, лимитируется только пределом обнаружения метки. Увеличивая концентрацию иммобилизованных и меченых антител, в идеальном случае можно значительно снижать нижний предел детекции антигена. Однако реально возрастающий при этом вклад неспецифических взаимодействий делает этот путь неосуществимым.
§ 5. Некоторые свойства иммобилизованных антител
Применение в ИФА иммуносорбентов позволяет проводить определение любых соединений, независимо от их валентности, размеров, структуры и молекулярной массы. Однако возможности твердофазных систем анализа (ниЗкний предел обнаружения антигена, время, воспроизводимость) в значительной степени определяются такими величинами, как концентрация, аффинность и стабильность иммобилизованных антител. В связи с этим ниже дана краткая информация об этих параметрах и путях их определения на примере наиболее распространенных пористых и непористых носителей.
