Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика иммуноферментного анализа" -> 88

Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилов Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaipraktika1999.djvu
Предыдущая << 1 .. 82 83 84 85 86 87 < 88 > 89 90 91 92 93 94 .. 123 >> Следующая

ходимое для^ связывания, например с поверхностью непористого полистирола, не превышает 2—4 ч и уменьшается при повышении температуры от 4 до 37°С.
В ряде случаев прямая адсорбция антигена на поверхности полимерных носителей невозможна или нежелательна. Чаще всего с подобной ситуацией приходится встречаться, когда антигенами являются низкомолекулярные соединения, имеющие одну антигенную детерминанту, например лекарственные препараты, пестициды, некоторые стероидные и тироидные гормоны и т. д.
• При адсорбции таких молекул могут возникать следующие сложности: 1) в силу своих свойств гаптен не сорбируется на пластике; 2) гаптен водонерастворим и может быть адсорбирован только из органического растворителя, растворяющего полимер и приводящего к ухудшению оптических свойств; 3) гаптен адсорбируется в мягких условиях, но его детерминанта становится стери-чески недоступной для последующего взаимодействия с антителами,
В указанных случаях гаптен целесообразно адсорбировать, предварительно ковалентно связав с макромолекулярным белком-носителем, который впоследствии прочно связывается с полимером.
• При получении такого конъюгата необходимо: 1) исключить возможность модификации групп, образующих антигенную детерминанту; 2) использовать в качестве белка-носителя другой белок, а не тот, который применялся при синтезе конъюгата гаптен-носи-тель при иммунизации; 3) по возможности стремиться применять сшивающий реагент, отличный от используемого при получении конъюгата для иммунизации с целью избежания связывания адсорбированным конъюгатом антител, специфичных не к гаптену, а к участку связывания гаптена с белком-носителем.
Ковалентное связывание. Иммобилизацию антигенов путем ковалентного связывания проводят, используя подходы, разработанные для получения нерастворимых производных антител и ферментов. Выбор сшивающего агента и метода связывания необходимо проводить с учетом доступных функциональных групп, модификация которых не снижает способность агента эффективно взаимодействовать с антителами.
§ 4. Неспецифическое связывание с иммуносорбентом
Важной задачей при проведении анализа с применением иммуносорбентов является максимальное снижение связывания меченного ферментом соединения и других компонентов с поверхностью носителя и пробирок, в которых проводится измерение. При определении микроколичеств веществ интерпретация результатов анализа прн значительной неспецифической сорбции (связывание в отсутствие специфических антител) край-
не затруднительна. Способностью к адсорбции соединений различной природы в условиях проведения иммунохимического анализа в большей или меньшей степени обладают все применяемые в ИФА носители. Причина связывания зависит от природы сорбента и может быть обусловлена захватом антигенов или антител в поры носителя, а также образованием ионных, гидрофобных и других связей.
Наиболее эффективным путем подавления связывания с носителем является проведение анализа в буфере, содержащем неионные детергенты (твин-20, тритон Х-100, Х-305 и др.), а также бел* ки, обладающие высоким сродством к центрам сорбции носителя
Рис. 25. Изменение активности конъюгата IgG — пероксндаза в растворе (начальная концентрация 4,3 иМ) в фосфатном буфере, содержащем 0,05% тритона Х-100 (/) и в том же буфере без детер^ гена (2)
Рис. 26. Связывание конъюгата ни* сулина (Инс — ПХ) со специфическими (I) и иеспецифическимн (2) антителами морской свиики, адсорбированными на полистирольном планшете для ИФА:
по оси ординат — оптическая плотность А при Я=490 им продукта Пероксидазиой ре-акции окисления о-фенилендиамина перекисью водорода; по оси абсцисс — концентрация конъюгата в лунках планшета
(0,1% БСА, 10% сыворотка крови и т. д.). На рис. 25 приведены зависимости, отражающие изменение связывания конъюгата IgG-пероксидаза с поверхностью полистирольных Пробирок в присутствии тритона Х-100.
Предотвращение связывания белков с поверхностью кремнеземных носителей (силохром, пористое стекло) успешно достигается при их модификации поливинилпирролидоном. Используется Также предварительная блокировка центров сорбции носителя пос-ле иммобилизаций антител или антигена Инертными белками (альбумин, у-глобулин и др.), которые следует выбирать с учетом возможности их связывания с анализируемым антигеном. Например, альбумин способен эффективно адсорбировать эстрадиол. Очевидно, что блокировка носителя альбумином при анализе эстра-диола может привести только к увеличению Вклада неспецифических взаимодействий.
Как правило,, при проведении ИФА интерес представляет знание неспецифического связывания компонентов не с нативным носителем, а с иммуносорбентом — модифицированным носителем с иммобилизованными антителами (антигеном). В ряде случаев сама процедура модификации приводит к снижению степени связывания. Например, активированный - 7-аминопропилтриэтоксисила-ном силохром в меньшей степени адсорбирует IgG, чем исходный носитель, что, по-видимому, связано с частичным экранированием отрицательного заряда и увеличением гидрофобности поверхности за счет присоединения молекул силана.
Предыдущая << 1 .. 82 83 84 85 86 87 < 88 > 89 90 91 92 93 94 .. 123 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed