Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
ГлутароВый
альдегид
5
О
возможнцсть быстрого получения «чистых» иммобилизованных антител делает его перспективным для целей ИФА.
Иммобилизация антител на магнитных носителях. Ранее отмечалось, что одним из недостатков применения для целей анализа иммуносорбентов на основе гранулированных носителей являются методические сложности, связанные с точным- дозированием, центрифугированием, потерями при промывках и т. д. Многие сложности могут быть устранены при использовании носителей, обладающих магнитными свойствами.
Наиболее распространены носители на основе оксидов железа и феррита бария. Магнитный носитель также может быть получен на основе полиакриламида и агарозы путем добавления Fe304 в смесь мономеров при полимеризации. Последующая иммобилизация антител на магнитных носителях может проводиться одним из описанных ранее методов. Магнитные носители позволяют проводить разделение компонентов анализируемой смеси во многих образцах одновременно без применения центрифугирования, исключить потери сорбента при промывках и в значительной степени автоматизировать процедуру анализа.
• Изменяющиеся устройства для проведения анализа с магнитными носителями позволяют одновременно анализировать несколько десятков образцов с быстрым переносом и промывкой частиц сорбента, а также одновременную для всех проб остановку ферментативной реакции, что существенно для получения хорошей воспроизводимости результатов ИФА.
Иммобилизация антител на водорастворимых полимерах. Новым подходом в иммунохимическом анализе является применение антител, иммобилизованных на обратимо растворимых иммуносорбентах, что позволяет проводить анализ в растворе, а затем быстро разделять компоненты путем перевода носителя в нерастворимое состояние. Данный путь дает возможность сочетать чувствительность твердофазного анализа с быстротой гомогенного. В качестве водорастворимого носителя может быть использован альгинат натрия и полиметакриловая кислота (ПМАК).
Методика получения водорастворимого иммуносорбента на ос-нове ПМАК.
Используют полученную радикальной Полимеризацией ПМАК с МГ=26П0. Раствор ПМАК с концентрацией 10 мг/мл доводят до pH 5,0 2 М КОН. Добавляют 15 мг водорастворимого карбодиимида н 10 мг N-оксисукциннмида. Смесь инкубируют 30 мин при 20 °С при перемешивании, поддерживая значение pH 5,0. Затем 1 М КОН доводят pH до 7,8—8,0 и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. Добавляют 20 мг IgG в 0,01 М К-фосфатном буфере (pH 7,8), содержащем 0,1 М NaCl, инкубируют 2 ч при комнатной температуре и перемешивают, контролируя и поддерживая pH 7,8—8,0. Затем диализуют в течение ночи против 0,1 М Ыа-фосфатного буфера (pH 5,5) с 0,42 М NaCl. Несвязав-Щийси IgG отделяют гельфильтрацией на колонке (2X100) см с ультрагелем АсА-44, уравновешенным 0,1 М Na-фосфэтиым буфером (pH 5 5) с 0,4 М NaCl, Выход компонентов регистрируют спектрофотометрически при л*=280 нм, Объе-
диияют фракции первого пика (иммуносорбент) и диализуют против 0,01 М К-фосфатиого буфера (pH 7,4) с 0,1 М NaCl в течение ночи при 4°С.
Выделенный иммуиосорбент при хранении при +4°С может быть использован для анализа в течение нескольких месяцев.
Иммобилизация антител микрокапсулированием. При ковалентной или адсорбционной иммобилизации часть активных центров антител может снижать или полностью утрачивать способность взаимодействовать с антигеном. Эффективным путем сохранения нативной структуры антител является иммобилизация микрокапсулированием, широко используемая для получения препаратов ферментов, антигенов (для обеспечения пролонгированного эффекта при иммунизации) и лекарств для достижения их направленного транспорта в организме.
Принцип разделения компонентов в анализе с применением микрокапсулированных антител основан на том, что продиффун-дировавший внутрь капсулы и связавшийся с антителами меченый антиген теряет способность переходить обратно в раствор вследствие ограниченного размера пор. Как следует из принципа разделения, микрокапсулирование для целей анализа не является универсальным подходом. Эффективное применение таких препаратов антител возможно только при использовании в анализе низкомолекулярных антигенов, меченных небольшими по размерам метками (изотоп, кофактор), что обеспечивает свободную диффузию конъюгата антиген — маркер внутрь капсулы.
§ 3. Иммобилизация антигенов
Как и антитела, антигены могут быть ковалентно связаны с носителем либо адсорбированы на нем. Многообразие соединений, которые могут являться антигенами, затрудняет выработку каких-либо единых рекомендаций. Выбор метода связывания антигена с носителем зависит от структуры и молекулярной массы соединения.
Адсорбционная иммобилизация антигенов. Многие макромоле-кулярные антигены — пептидные гормоны, белки, ферменты, липо-Полисахариды, денатурированная ДНК н т. д., а также целые вирусные частицы, компоненты клеток (например, рибосомы) и целые Клетки — могут быть связаны с поверхностью полимерных н неорганических носителей путем адсорбции в условиях, идентичных описанным для иммобилизации антител. Различия чаще всего относятся к оптимальным значениям pH, которые могут изменяться от нейтральных до щелочных (pH 6,8—9,6) в зависимости от заряда сорбируемой молекулы. Длительность процесса адсорбции и максимальное количество связанного с поверхностью антигена являются характеристиками, индивидуальными для каждого процесса и зависящими от гидрофобности, заряда и молекулярной массы Молекулы. Однако для многих антигенов время, необ-
