Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Подходы, основанные на комбинации методов адсорбции и ковалентного связывания, все шире используются в ИФА, обеспечивая улучшение воспроизводимости результатов анализа.
Адсорбционная иммобилизация антител. Этот метод наиболее распространен в ИФА, что обусловлено, в основном, крайней простотой процедуры иммобилизации, не требующей применения каких-либо активирующих агентов.
При добавлении раствора антител в лунки планшетов или пробирки из полимерных материалов часть молекул адсорбируется на поверхности носителя за счет ионных и гидрофобных взаимодей-
ствий, а также образования водородных связей. Количество сорбированного белка определяется природой полимера, площадью поверхности, временем контакта, концентрацией белка, pH и ионной силой буфера, температурой. На рис. 23 приведены зависимости количества связанного на носителе конъюгата от его содержания в растворе и времени инкубации. Насыщение центров сорбции полистирола достигается при концентрации белка, равной 2—
5 мкг/мл. При этом с поверхностью лунки (5«1,6 см2) связывается около 60 нг белка. Длительность процесса адсорбции при 4°С и pH 7,4 составляет около двух часов, но 60% сорбированного белка связывается за первые 30 мин.
Полной корреляции данных по сорбционным свойствам полистирола в литературе не наблюдается. В известной степени это может быть объяснено тем, что в экспериментальных работах применяли носители разных фирм, которые могут отличаться составом и сорбционными свойствами полимера. Другая причина может заключаться в том, что в разных опытах использовались IgG различных животных, которые отличаются по свойствам. Так, при исследовании адсорбции IgG быка на полистирольных пробирках показано, что на площади 6,5 см2 связывается около 1,8 мкг белка (или 280 нг/см2). На полистирольных пробирках (LKB, Швеция) сорбируется ~ 100 нг IgG человека на 1 см2.
• Как отмечалось ранее, адсорбционная связь белка с поверхностью менее прочна, чем ковалентная, что является одним из основных недостатков данного способа иммобилизации. Например, при сравнительном изучении десорбции БСА с активированной бромцианом бумаги и полистирольных кювет (фирмы Labsystems, Финляндия) показано, что в случае ковалентной пришивки и адсорбции в процессе анализа с подложки смывается 13 и 37% белка соответственно.
Методика адсорбции антител.
Для адсорбции могут быть использованы IgG-фракции аитисыворотки либо антитела, выделенные известными методами.
В луики планшетов для ИФА вносят по 0,2 мл раствора белка в 0,01 М К-фосфатиом буфере (pH 7,4) с 0,1 М NaCl (PBS) с концентрацией 5 мкг/мл. Планшеты накрывают крышками и выдерживают иочь при +4°С*. Удаляют'белок и промывают луики 3—4 раза раствором ФБ, содержащим 0,05% детергента твии-20 или тритои Х-100. Подготовленные таким образом планшеты готовы для , проведения ИФА. При необходимости длительного хранения планшеты высушивают иа воздухе и хранят при +4°С (в герметически закрытых пластиковых пакетах в присутствии осушителя). При соблюдении правил хранения адсорбированные антитела могут использоваться для анализа в течение нескольких месяцев.
* Проведение адсорбции в течение ночи является удобным в методическом плане с точки зрения планирования времени анализа. Как указывалось ранее, при дайной концентрации белка длительность процесса адсорбции можно ограничить несколькими часами,
Аффинная иммобилизация антител. Выделение специфических антител из сыворотки включает стадию их адсорбции на иммобилизованном антигене и последующую элюцию путем разрушения связи антиген — антитело при сильно кислых или щелочных значениях pH либо концентрированными растворами солей (например, NH4CNS). Выделение в столь экстремальных условиях может неблагоприятно сказываться на аффинности антител, а последующее ковалентное или адсорбционное закрепление молекул на носителе в ряде случаев приводит к дальнейшему снижению способности эффективно связывать антиген.
Рис. 24. Схема получения иммобилизованных антител:
а — через связь аитигеи — антитело; б — дополнительно ковалентно связанных с антигеном глутаровым альдегидом
Отсюда определенный интерес представляет использование в анализе иммуносорбентов, полученных путем аффинного связывания специфических антител с иммобилизованным на носителе антигеном. Связь антиген — антитело обратима, поэтому для предотвращения смывания антител с сорбента разработаны пути последующего ковалентного закрепления молекул, образовавших специфический комплекс на носителе. Для стабилизации комплекса эффективно применяются обычные сшивающие агенты: глута-ровый альдегид, диазиды, изоцианаты. Процедура иммобилизации включает инкубацию связанного с носителем антигена с антисывороткой, отмывку носителя, проведение реакции с сшивающим антигеном и заключительную отмывку для удаления избытка (рис. 24). Процесс может проводиться как в реакторах перемешивания, так и в колоночном режиме. Данный подход детально изучен на примере иммобилизации антител против сывороточного альбумина человека на сефарозном сорбенте. В результате такого связывания по крайней мере половина активных центров иммобилизованных антител способна принимать- участие в последующих реакциях с антигеном, что является недостатком метода. Однако
