Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Наиболее широко применяемыми носителями в твердофазном ИФА являются 96-луночные планшеты и пробирки из оптически прозрачного полистирола, поливинилхлорида или других полимерных материалов, с внутренней поверхностью которых связываются антитела. Как отмечалось ранее, в большинстве случаев иммобилизацию проводят адсорбционно, что упрощает процедуру, но снижает прочность связи белка с носителем. Увеличение прочности связывания может быть достигнуто при ковалентном закреплении антител на пластике.
Существующие способы ковалентной иммобилизации белков и ферментов на полистироле и его производных в основном 'разработаны для макропористых носителей и полистирольных гелей, используемых в ионообменной хроматографии. Сложность ковалентной пришивки для целей ИФА состоит в том, что модифика-ции должно подвергаться готовое штампованное изделие из оптически прозрачного непористого полистирола (или другого полимера). При этом оптические свойства носителя в процессе активации не должны ухудшаться, так как йа конечной стадии анализа Лунки планшета или пробирка служат кюветой Для фотометриро-вания продукта ферментативной реакции. С другой стороны, условия модификации должны исключать изменение однородности поверхности носителя (частичное растворение «набухание» полимера
и т. д.), вызываемое многими органическими растворителями. В связи с этим используемые подходы для ковалентного закрепления антител на оптически прозрачных полимерных носителях для ИФА весьма ограничены.
• Наиболее простой метод заключается в предварительной обработке планшетов или пробирок из полистирола или поливинилхлорида водным раствором глутарового альдегида. Добавляемые затем антитела ковалентно связываются с активированным носителем. Механизм активации пластика альдегидом детально не изучен. Не исключено, что глутаровый альдегид, в основном существующий в форме олигомеров, просто прочно адсорбируется на поверхности полимера. Это согласуется с данными о минимальной фиксирующей способности мономерной формы альдегида. В связи с этим употребляемый в литературе в данном случае термин «ковалентная иммобилизация» является некорректным, так как ковалентная связь образуется только между белком и сшивающим антигеном, но не между белком и носителем. Однако экспериментально показано, что прочность связывания антител с полимером в результате подобной процедуры возрастает. Например, при адсорбции антител против HBs-антигена на планшетах из поливинилхлорида в процессе инкубации с сывороткой крови десорбируется до 43%, а при связывании через глутаровый альдегид— до 12% ангител соответственно.
Методика.
В лунки планшетов для ИФА из поливинилхлорида вносят по 100 мкл раствора 2%-ного глутарового альдегида в К-фосфатном буфере, pH 5,0. Инкубн-оуют 2 ч при комнатной температуре и трижды промывают луики 0,01 М К-фосфатным буфером с 0,1 М NaCl, pH 7,0. Затем вносят в лункн по 100 мкл IgG-фракции антисыворотки к HBs-антигент в концентрации 30 мкг/мл в 0,1 М Na-карбонатом буфере, pH 9,5, и инкубируют в течение ночи при 4°С. После 3-кратной промывки фосфатным буфером с 0,L М NaCl, pH 7,0, планшеты готовы для применения в ИФА.
Другим доступным реагентом для активации полистирола и полипропилена является толуол-2,4-диизоцианат (ТЦ). При использовании для иммобилизации на полистирольных пробирках высоких концентраций IgG (1 мг/мл) в случае активации ТЦ связывается белка в 2,7 раза больше,.чем при активации глутаровым альдегидом, и в 1,7 раза больше, чем при простой адсорбции. Однако при концентрациях IgG 0,1 и 0,01 мг/мл количество белка, связавшегося через глутаровый альдегид, в 1,3 раза выше, чем через ТЦ. Аналогичные закономерности сохраняются при связывании IgG с полипропиленом.
Предположительно эффект связывания ТЦ с твердой фазой основан на присоединении (сорбции?) реагента иа поверхности полистирола, модифицированной органическим растворителем. Затем изоцианатная группа реагента взаимодействует с аминогруппами лизина IgG, образуя ковалентную связь.
Методика.
В полистирольиые (или полипропиленовые) пробирки добавляют 0,5 мл 0,5%-иого ТЦ, раствореииого в четыреххлористом углероде, и быстро отсасывают раствор (чтобы ие допустить существенного растворения полимера). Оставляют пробирки иа 3 ч при комиатиой температуре для высушивания остатков растворителя. Вносят в пробирки IgG в 0,5 мл 0,01 М .N-а-фосфатиого буфера (pH 7,2), содержащего 0,14 М NaCl и 0,1% NaN3. Инкубируют 20 ч, отсасывают раствор и добавляют в пробирки 0,6 мл 1%-иого БСА в том же буфере для блокировки активных групп ТЦ. Инкубируют 2 ч и трижды промывают пробирки фосфатным буфером.
Рис. 23. Изотерма адсорбции мечеииых пероксидазой аитител в луиках полисти-рольиого планшета для ИФА, pH 7,4 (а); и кинетика адсорбции коиъюгата АТ—ПХ (21 пмоль) в луике полистирольиого планшета для ИФА; pH 7,4 (6):
а — по оси абсцисс—начальное количество меченных пероксидазой антетел (АТ—ПХ); по оси ординат — количество антител, связавшихся с твердой фазой; б — по оси абсцисс — время, мнн
Последний из применяемых подходов основан на предварительной сорбции на пластике полн-?-лизина, который адсорбируется на поверхности практически необратимо. Далее с помощью глутарового альдегида (или другого агента) с полимером могут быть связаны антитела, антигены, целые бактериальные клетки. Процедура сорбции поли-1-лизина включает добавление его в лунки планшета для ИФА в концентрации 0,1 мг/мл в 0,15 М фосфатном буфере (pH 7,4), инкубацию в течение 30—60 мин и промывку лунок буфером.
