Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Для увеличения прочности связывания белка с носителем двойная связь может быть восстановлена боргидрядом натрия. Методика.
1. 10 г силохрома кипятят в течение 2 ч в 60 мл безводного толуола в присутствии 2 мл 7-амииопропилтриэтоксисилана. Промывают силохром 0,5 л толуола и сушат 5 ч при 50 °С и затем 5 ч при 1.20 °С в вакуумной сушилке при 3990 Па (30 мм рт. ст.). Аминироваииый силохром может длительное время храниться при комнатной температуре.
2. К 1 г аминированиого силохромэ добавляют 10 мл 1%-иого раствора глутарового альдегида в холодной дистиллированной воде, инкубируют при медленном перемешивании 4 ч при 4°С и отмывают носитель от избытка альдегида водой. В процессе активации носитель изменяет цвет с белого иа красноватый. Полноту отмывки альдегида контролируют спектрофотометрически при X— ==280 им. Полученный сорбент может быть использован для иммобилизации немедленно или длительно храниться в высушенном состоянии.
3. К 1 г активирова иного силохрома в 10 мл 0,01 М К-фосфориого буфера (pH 7,4), содержащего 0,1 М NaCl и 0,05% тритона X-1Q0, добавляют IgG-фракцию аитисыворотки или аффииио выделенные антитела. Инкубируют при комнатной температуре и мягком перемешивании. Процесс связывания белка с носителем контролируют спектрофотометрическн при X—280 им. После прекращения изменения оптической плотности надосадочного раствора (рис. 22) (обычно реакция проходит за 2—3 ч) отмывают носитель 1 М раствором КС1, затем
0,01 М К-фосфатным буфером с 0,1 М NaCl и хранят в том же буфере при +4°С,
О |—он + (c2H5o)3si—(ch2),_nh;
кремнезем ^-АПТЭС
Я \ « *
— §- о S -ЧСН^ МНд(|-МН2)
__п/
—о"
=' |-
глутарввый альдегид
О
Количество связавшегося с носителем белка определяют по разности начального количества белка и его содержания и промывных водах. В зависимости от удельной поверхности силохрома с 1 г связывается от 20 до 50 мг белка. Для удобства отбора проб гранулы иммуносорбента целесообразно гомогенизировать до образования однородной суспензии, которая легко может дозироваться автоматическими пипетками и лабораторными дозаторами.
Таким же путем может осуществляться иммобилизация антител на макропористых силикагелях и пористых стеклах, также используемых для целей ИФА, механизм активации которых аналогичен рассмотренному.
Иммобилизованные на кремнеземных носителях антитела длительное время сохраняют способность специфически взаимодействовать с антигеном.
Иммобилизация антител на сефа-дексе, сефарозе, целлюлозе. Широко используемые в биохимических лабораториях носители сефадекс G-200, се-фароза 4В, карбоксиметилцеллюлоза могут успешно использоваться для иммобилизации антител. Чаще всего полисахаридные носители активируют бромцианом. Схема реакции:
60 НО ISO i,MuH Рис. 22. Кинетика ковалентного связывания глобулииовой фракции антител с 0,5 г силохрома G = 20 М, активированного глутаровым альдегидом, 20 °С, pH 7,4
/ОН a) + BrCN
NOH
полисахарид
*\
¦О—C=N
ОН
/ОСОЫН2
R\0H
^ инертный карбоиат
*4 >=NH N0/
активный
имидокарбонат
(О
(2)
б) (2) + NH2—0
\ (
!=N—
R^ ЧС—NH—(м)
'ОН
NH
,0—С—NH—(м)
К И
хон °
(3)
(4)
(5)
Взаимодействие полисахарида с бромцианом приводит к образованию нереакционноспособных эфиров карбаминовой кислоты (1) и активных имидокарбонатов (2). Последние в слабощелочной среде быстро реагируют с аминогруппами белка, образуя N-замещенные имидокарбонаты (3), лроизводные изомочевины (4) и N-замещенные эфиры карбаминовой кислоты (5).
Методика.
1. 200 мг сефадекса G-200 выдерживают в течение 20 ч в 12 мл дистиллированной воды. Затем добавляют 4 мл водного раствора, содержащего 200 мг BrCN. (Соблюдать осторожность! Реагент обладает раздражающим н сильным токсическим действием.) Раствор доводят до pH 11 1 М NaOH и поддерживают это значение pH на автоматическом титраторе. Суспензию размешивают при 23—26 °С. Активированный гель переносят на стеклянный фильтр, отсасывают и промывают 300 Мл холодного 0,1 М гидрокарбойата иатрия и 0,3 М раствором гидробикарбоната калия.
Аналогичным или модифицированным способом активируют сефарозу.
2. К 1 г активированного носителя добавляют IgG-функцию антисыворотки или выделенные антитела в 0,1 М NaHC03 (коммерческий препарат BrCN-сефа-розы предварительно замачивают в 10 мМ НС1 и промывают 0,1 А1 NaHC03). Инкубируют в течение суток при мягком перемешивании при комнатной Температуре. Промывают иммуносорбент последовательно 1 М этаноламином (2 ч для блокировки свободных активных групп носителя), 0,5 М NaHC03, 0,2 М ацетатным буфером (pH 4,0), а затем 0,01 М К-фосфатным буфером, содержащим 0,1 М NaCl (или другим буфером, который впоследствии будет использован в анализе). Хранят иммуиосорбент в том же буфере при +4“С.
Сочетание адсорбции и ковалентного связывания при иммобилизации антител на пластиковых планшетах и пробирках для ИФА.
