Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Перечисленным требованиям соответствуют многие носители, в том числе и широко используемые в биохимических лабораториях для очистки и разделения белков. В связи с этим первоначально в гетерогенных методах ИФА применялись такие носители, как целлюлоза, сефароза, сефадекс, биогель, силохром, пористое стекло, оксиды металлов. Эти материалы обладают высокой емкостью, легко подвергаются химической модификации,' имеют хорошие гидродинамические свойства. Неорганические носители (силохром, пористое стекло) не подвержены воздействию микрофлоры, что позволяет использовать иммобилизованные, на них антитела длительный срок без применения консервантов. Одним из немногих (но существенных) недостатков гранулированных носителей является сложность их точного дозирования и трудность промывок без потерь используемых в анализе микроколичеств иммуносорбента. Особенно остро эти вопросы встают при необходимости проведения не единичных, а массовых анализов.
• С начала 70-х годов в практику ИФА вошли методы, основанные на иммобилизации антител и антигенов непосредственно на стенках посуды, в которой проводится анализ. В основном для такого анализа используют пробирки и планшеты из непористых полимерных материалов —полистирола, поливинилхлорида, полиметакрилата и т. д. Многие вещества (белки, полисахариды, пептидные гормоны, липополисахариды, денатурированная ДНК ит. д.) могут быть адсорбционно связаны с поверхностью таких полимеров, что значительно упрощает процедуру иммобилизации. В настоящее время этот подход является одним из основных в практике твердофазного ИФА. Широкое применение метода обусловлено его простотой и возможностью автоматизации за счет того, что каждая пробирка или лунка планшета является отдельным реактором, в котором проходят все стадии анализа, начиная с иммобилизации антител (или антигена) и кончая измерением фи-
зико-химического параметра ферментативной реакции. К недостаткам данного подхода относится невысокая емкость непористых материалов и возможность элюции части адсорбированного белка с подложки в процессе инкубаций и промывок, вследствие чего ухудшаются чувствительность, точность и воспроизводимость результатов анализа.
Основным фактором, обусловливающим возможность проведения анализа и корректной интерпретации его результатов, является однородность сорбционных свойств пробирок или планшетов для ИФА. В связи с этим производство данных материалов требует специально отлаженной технологии, включающей строгий контроль качества изготовляемой продукции. '
• Другой подход основан на использовании материалов в форме шариков, дисков или трубочек, каждый из которых предназначен для проведения одного анализа. Процедура переноса носителя из пробирки в пробирку, отмывки и т. д. осуществляется с помощью пинцета или вакуумной присоски. Иммобилизация материала может осуществляться адсорбционно или ковалентно. Данный путь позволяет увеличить количество иммобилизованного белка за счет увеличения поверхности, но сохранить при этом методическую простоту операций. Примером подобных носителей могут служить полимерные шарики, нитроцеллюлозные диски, силиконовые трубки, пленки из полимерных материалов и т. д. Кроме этого, антитела (или антигены) могут быть связаны с активированной бумагой или нитроцеллюлозными мембранами, на поверхности которых проводят анализ многих проб.
В выпускаемых коммерческих наборах антитела (или антигены), как правило, находятся в иммобилизованном состояний, и .задачей является их правильное использование в соответствии с прилагаемой инструкцией. Но при разработке анализа какого-либо соединения методом твердофазного ИФА с необходимостью иммобилизации сталкивается все исследователи. Поэтому ниже будут рассмотрены методы иммобилизации антител и антигенов с применением доступных материалов и свойства получаемых препаратов.
§ 2. Иммобилизация антител
Ковалентная иммобилизация антител. Ко-
валентное связывание антител с носителями осуществляют главным образом за счет свободных амино- и карбоксильных групп, ИахоДящХися на поверхности глобулы макромолекулы. Для связывания антител могут использоваться многие методы, разработанные для иммобилизации белков и ферментов на носителях органической и неорганической природы. Эти методы различны по степени сложности синтеза и доступности реагентов. Многие из Них могут быть корректно осуществлены только специалистами в области органической и биоорганической химии.
Так как в различных лабораториях часто возникает потребность получения иммуносорбентов, остановимся на нескольких простых, малостадийных методиках, для. проведения которых имеются готовые активированные носители или легко доступные полупродукты.
Иммобилизация антител на силохроме, макропористом силикагеле и пористом стекле. Силохромы — неорганические пористые носители на основе кремнезема, выпускаются отечественной промышленностью для целей хроматографии. Различные марки сило-хромов отличаются диаметром пор (35—250 нм) и удельной поверхностью (25—130 м2/г). Для иммобилизации антител чаще всего используют силохром, предварительно модифицированный у-аминопропилтриэтоксисиланом (у-АПТЭС) и глутаровым альдегидом. Схема реакции:
