Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика иммуноферментного анализа" -> 81

Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилов Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaipraktika1999.djvu
Предыдущая << 1 .. 75 76 77 78 79 80 < 81 > 82 83 84 85 86 87 .. 123 >> Следующая

Суспензию 2Q0 мкг щелочной фосфатазы в 200 мкл буфера центрифугируют и осадок растворяют в 500 мкл 0,1 М фосфатного буфера, pH 6,8. Растворяют
2 мг тироксина в 4 мл диметилформамида и 100 мкл этого раствора добавляют к раствору фермента. Затем приливают 10 мкл 1,5%-ного раствора глутарового альдегида и перемешивают 2,5 ч при 25 °С. Конъюгат очищают хроматографированием на колонке (1ХЮ) см с сефадексом (G-100) в 0,1 М фосфатном буфере.
Метод с применением гетеробифункциональных сшивающих реагентов. Для получения конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими NH2-группы, в последнее время чаще всего используют гетеробифункциональные сшивающие реагенты, например N-оксисукцинимидный эфир л-малеимидобензойной кислоты (MBS) и другие:
Этим методом получают конъюгаты в основном с p-D-галакто-зидазой, которая содержит ~10 активных SH-групп й не теряет
I. (г)—NH, + 0=СН(СН2)3СН=0 + NH2—(F)—^ (г)—N—CH(CH2)3CH=N—(F)
NHHCI NHHCI NHHCI NHHCI
—- 0-NH-C-(CH2)-C-NH-(e)
NHHCI NHHCI
свою ферментативную активность в конъюгате, а также и с другими ферментами, содержащими SH-группы.
Синтез конъюгата бластицидина-S с р-D-галактозидазой.
ш
Приведем пример ускоренного способа без выделения промежуточных веществ и их очистки. К раствору бластицидина — S в 0,02 М фосфатном буфере, содержащем 0,1 М NaCl и 0,001 М MgCl2, pH 7,0, добавляют в 10 раз меньшее количество N-окснсукцнннмидиого эфира 7-малеимндомасляной кислоты и перемешивают 30 мин при 30 °С. Затем добавляют раствор фермента и еще инкубируют некоторое время. Реакционную смесь хроматографируют на колонке с сефадексом G-100 в том же буфере и собирают- фракцию, имеющую ферментативную активность.
Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими углеводные остатки. Такие гаптены, как дигоксин, аденозин и другие, имеющие в своей структуре углеводные группировки, могут быть легко конъюгированы с ферментами путем их окисления перйодатом натрия до производных с альдегидной группой и последующим взаимодействием с МНг-группами фермента:
©~
сн2он
он
NaI04
©-¦
сн,он
I 2
/°--- т- (D-nh2
ч сн
f II
II 0
0
©-¦
CHjOH
§ 4. Получение конъюгатов антигенов (антител) с субстратами
Конъюгаты антигенов (антител) с субстратами нашли широкое применение в хеми- и биолюминесцентных системах детекции.
• Хемилюминесцентные реакции детекции имеют следующие преимущества: отсутствие фоновых реакций, низкий предел обнаружения, высокое отношение полезного сигнала к фоновому (>50)
и др. В качестве меток используют чаще всего люминол, изолюми-нол или их производные. Синтезы их конъюгатов с антителами (антигенами) проводят в мягких условиях, чтобы сохранить их иммунологические свойства. Для конъюгирования применяют реакционноспособные производные субстратов, которые получают обычными методами тонкого органического синтеза. Ниже будут приведены лишь схемы и методики получения таких конъюгатов.
Люминол и изолюминол диазотируют в мягких условиях, и полученное диазопроизводное взаимодействует с тирозиновыми н триптофановыми остатками антител:
Синтез конъюгата антител с люминолом.
К охлажденной до 0°С суспензии 1 ммоля люминола в 5 мл 1 и. НС1 добавляют по каплям при перемешивании в течение 15—20 мин 1,5 ммоля KNO2 в 1 мл воды. При этом цвет раствора изменяется от желтого до оранжевого. Избыток нитрующей смеси удаляют добавлением нескольких капель 1 М мочевины. К раствору IgG (15 г/л) в PBS при охлаждении до 4"С добавляют раствор диазолюминола, доводят pH раствора до 9,0 1 М К?С03 и перемешивают 24 ч при 4 “С. Полученный конъюгат очищают на колонке (30X2,5) см с носителем Ultragel А4 в PBS.
Для получения конъюгатов часто применяют коммерчески доступное производное изолюминола — Ы-(4-аминобутил)-Ы-этил-изолюминол (ABEI). Это соединение содержит аминогруппу, участвующую в связывании с белком. Известно два способа модификации: 1) с помощью тиофосгена или 2) через активированный ге-мисукцинимидный эфир по схемам:
Способ 1
\ch2)4nhcs&
ABEI
О
Способ 2,
(CH,)4NHCOCH2CHjCOOH
ABEI
/С2Н5
V,
\
(CH,)4NHCOCH2CH2 coon;
^(CH2)4NHC0CH,CH2—CONH—^gG)
Синтез конъюгата антител с ABEI.
К раствору 18,5 мг (50 мкмоль) гемисукцинимидного производного ABEI в 800 мкл диметилформамида добавляют 5,75 (50 мкмоль) N-оксисукцинимида и затем. 30,9 мг (150 мкмоль) дицнклогекснлкарбодиимида в 200 мкл диметилформамида. Реакционную смесь инкубируют в темноте 20 ч, удаляют осадок и добавляют 100 мкл этого раствора к 1 мл раствора IgG (15 г/л) в PBS. Инкубируют смесь 24 ч при 4 °С в темноте, удаляют образовавшийся осадок и хроматографируют на колонке (30X2,5) см с носителем. Ultragel А4 в 0,05 М трис-HCl буфере, pH 8,0.
Предыдущая << 1 .. 75 76 77 78 79 80 < 81 > 82 83 84 85 86 87 .. 123 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed