Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Синтез конъюгата IgG с щелочной фосфатазой с помощью глутарового альдегида (одностадийный метод).
К 5 мг щелочной фосфатазы добавляют 0,85 мл раствора IgG (2 мг/мл) в 0,01 М фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl, pH 7,4, и диализуют в течение ночи при 4 °С против того Же буфера для удаления солей аммония. Разбавляют раствор буфером до 1 мл и добавляют 10 мкл 25%-ного раствора глутарового альдегида. Перемешивают реакционную смесь 2 ч при комнатной температуре и диализуют в течение ночи при 4°С против того же буфера и затем против 0,01 М трис-буфера, pH 8,0. Полученный раствор конъюгата разбавляют до 4 мл трис-буфером, добавляют БСА до 1% и NaN3 до 0,02%, фильтруют на фильтре с диаметром пор 0,2 мкм и хранят при 4 °С.
Синтез конъюгата IgG с пероксидазой хрена с помощью глутарового альдегида (двухстадийный метод) .
Растворяют 10 мг пероксидазы хрена (RZ-3,0) в 0,2 мл 0,1 М фосфатного буфера,- содержащего 0,15 М NaCl и 1,25%-ного глутарового альдегида, pH 6,8, и перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Удаляют избыток глутарового альдегида диализом против 0,15 М раствора NaCl или хроматографированием на колонке (1ХЮ см) с сефадексом G-25. Разбавляют до 1 мл 0,15 М NaCl, добавляют 1 мл раствора IgG (5 мг/мл), содержащего 0,15 М NaCl и 0,1 мл 1 М карбонатного буфера, pH 9,5. Инкубируют 24 ч при 4°С, затем вносят 0,1 мл 0,2 М раствора лизина для остановки реакции. Инкубируют 2 ч Щ)и комнатной температуре и диализуют в течение ночи в 0,01 М фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl, pH 7,2. Конъюгат осаждают эквивалентным объемом насыщенного раствора (NH^SOt и растворяют в 1 мл фосфат-
ного буфера. Раствор диализуют или хроматографируют на колонке (1X10 см) с сефадексом G-25 в фосфатном буфере. Раствор центрифугируют при 10 000 g в течение 30 мин, удаляют осадок, добавляют БСА до 1 % и фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Полученный конъюгат хранят при.—20°С или при +4°С с добавлением эквивалентного объема глицерина.
Известно несколько примеров получения конъюгатов IgG с пе-роксидазой хрена, щелочной фосфатазой, глюкозооксидазой и p-D-галактозидазой с применением в качестве гомобифункциональ-ного сшивающего реагента п-бензохинона. Метод основан на реакции га-бензохинона с амино- и тиогруппами белка, скорость которой зависит от pH. Благодаря этому был разработан двухстадийный способ получения конъюгатов, когда n-бензохиноновое производное белка получают при pH 6, выделяют, а затем смешивают с другим белком при pH 8. Одна из возможных схем реакции следующая:
Конъюгаты получаются с невысоким выходом, гетерогенны и имеют невысокую активность. Метод в настоящее время применяется все реже.
Для получения конъюгатов антител или их фрагментов с р-/)-га-лактозидазой применяется N, N'-о-фенилендималеимид — гомоби-функциональный сшивающий реагент, содержащий две малеимид-ные группы:
Малеимидные группы быстро реагируют с тиогруппой и медленно с другими функциональными группами белка. Конъюгаты с помощью N, N'-o-фенилендималеимида получают для белков и ферментов, содержащих SH-группы.
Однако дималеимидный метод может быть применен для получения конъюгатов и с другими белками. SH-группы могут быть введены в молекулы белков несколькими методами, в том числе путем частичного восстановления дисульфидных связей 2-меркаптоэтила-мином:
Синтез конъюгата Fab-фрагмента с fi-D-галактозидазой с помощью М, N'-o-фенилендималеимида.
К раствору 1,6 мг (3,0 нмоль) p-D-галактозндазы в 0,2 мл 0,1 М фосфатного буфера, pH 6,0, добавляют 6 мкл (1200 нмоль) 0,2 М (53,6 г/л) N, N'-o-феннленднмаленмида в диметилформамиде и перемешивают 20 мин при 30 °С. Реакционную смесь хроматографируют на колонке (1x45) см с сефадексом G-25 в фосфатном буфере, содержащем 1 г/л БСА с SH-группами, блокированными N-этилмаленмидом. К модифицированному ферменту добавляют 1,4 мг (15 нмоль) Fab в фосфатном буфере, содержащем 1 мМ ЭДТа, и инкубируют 20 ч прн 4°С. Добавляют 1/100 объема раствора NaN3 (100 г/л) и 1 иМ 2-меркаптоэта-нола для блокирования свободных малеимидных групп. Хроматографируют на колонке (1,5X45 см) с сефарозой 6 В в 0,01 М фосфатном буфере pH 6,5, содержащем 0,1 М NaCl, 1 мМ MgCb, 1 г/л NaNe и 1 г/л БСА.
Иногда,используют N, N'-оксидиметилендималеимид для получения конъюгатов дималеимидным методом, но этот реагент не имеет особых преимуществ перед N, N'-о-фенилендималеимидом и, кроме того, он менее доступен. Дималеимидный метод может проводиться при pH не выше 6,0—6,5, так как малеимидные группы нестабильны при высоких pH.
• Конъюгаты, полученные этим методом, практически не теряют ферментативную активность, дают низкое неспецифическое связывание и не образуют полимерных частиц.
Получение конъюгатов с помощью гетеробифункциональных сшивающих реагентов. Первым из гетеробифункциональных сшивающих реагентов для получения конъюгатов был применен N-оксисукцинимидный эфир м-малеимидобензойной кислоты (MBS). В 1976 г. с помощью этого реагента впервые был описан синтез конъюгата инсулина с 'P-D-галактозидазой. Метод заключается во введении малеимидных групп в молекулу белка при взаимодействии N-оксисукцинимидной группы сшивающего реагента с NH2-группой белка с образованием пептидной связи, которые затем уже реагируют с SH-группами фермента:
