Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика иммуноферментного анализа" -> 57

Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилов Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaipraktika1999.djvu
Предыдущая << 1 .. 51 52 53 54 55 56 < 57 > 58 59 60 61 62 63 .. 123 >> Следующая

ния, иг
Прогестерон 4,0 АВЕ1-Аг/Н202-М1Х *
Эстриол-16-глюкоронид 17,6 АВЕ1-Аг/Н202-МПХ
Эстрнол-16-глюкоронид 15 АВЕ1-Аг/Н202-МПХ
Метаболиты стероидов мочи 30,0 АВЕ1-Аг/Н202-МПХ
Эстрадиол 1,5 АВЕ1-Аг/Н202-МПХ
Тестостерон 1,0 АВЕ1-Аг/Н202-МПХ
Лютеинизирующий гормон 0,2 АВЕ1-Аг/Н202-МПХ
IgG 500 АВЕ1-Аг/Н202-МПХ
АВЕ1-Ат/Н202-МПХ
Кортизол 3 АВЕ1-Аг/Н202-МПХ
20 АВЕ1-Аг/Н202-МПХ
Ферритин 10 АВЕ1-Ат/Н202-МПХ •
Церулоплазмин 10 АВЕ1-Аг/Н202-МПХ
* АВЕ1-Ы-аминобутил-(Ы-этнл)нзолюминол; МПХ — микропероксидаза.
мах: 1) окисление Н2О2, катализируемое лактопероксидазой при pH 8,4 и 2) окисление супероксиданионом в диметилформамиде — наблюдается усиление интенсивности свечения. Увеличение квантового выхода является следствием внутримолекулярных механизмов, обусловленных специфическими взаимодействиями. Этот же эффект обнаруживается при окислении конъюгата биотин-изолю-минол — Нг02 в присутствии микропероксидазы в диапазоне значений pH 8,6—13,0. Нижний предел обнаружения биотина конкурентным методом составляет ~ 50 нМ,
Производные изолюминола широко используются при количественном определении стероидов методами как гомогенного, так и гетерогенного иммуиоанализа.
Процесс получения конъюгатов стероидов с хемилюминесцент-ным маркером включает два основных этапа: 1) модификацию стероида — введение в молекулу стероида карбонильной группы, ее активацию в присутствии карбодиимида и N-оксисукцинимида с образованием активированного эфира; 2) реакцию активированного эфира стероида с аминогруппой производного изолюминола
при щелочных значениях pH с образованием пептидной связи. Для очистки конъюгата используют тонкослойную хроматографию и характеризуют его либо спектрофотометрически, либЬ с помощью масс-спектрометрии.
В основе гомогенного хемилюминесдентного иммуноанализа стероидов лежит эффект усиления интенсивности хетилюминес-ценции при взаимодействии конъюгата стероид — изолюминол с антителами. Введение в эту систему свободного стероида ингибирует излучение, которое пропорционально концентрации добавленного стероида. Указанный принцип использован при разработке методов определения прогестерона, эстриол-16-глюкоронида, эст-риола. Несмотря на то что чувствительность этих методов сопоставима с РИА (5—10 мг), в ряде случаев собственная неспецифическая хемилюминесценция образца (плазмы или мочи) ограничивает возможности метода, затрудняет определение низких концентраций.
В гетерогенных методах ХИА стероидов для разделения свободной и связанной фракций конъюгата применяют вторичные антитела или уголь, активированный декстрином. Однако в этом случае так же, как и при постановке гомогенных методов ХИА, на результаты анализа влияет неспецифическая фоновая хемилюминесценция образца.
Наиболее простой способ снятия неспецифического фонового излучения состоит в использовании твердофазных вариантов метода. В качестве твердой фазы берут полистирольные пробирки, микропланшеты, полиакриламидные шарики. Иммобилизация антител (моноклональных или поликлональных) на полистироле осуществляется методом нековалентной физической адсорбции, а в случае полиакриламидных частиц — ковалентным связыванием. Различие в способах иммобилизации обусловливает некоторые различия в свойствах иммобилизованных антител. Из. всех перечисленных носителей полиакриламидные шарики, как правило, обеспечивают . повышенную стабильность и иммунореактивность иммобилизованных антител, более быструю кинетику специфического взаимодействия, что улучшает точность анализа и его воспроизводимость.
Коэффициенты корреляции данных, полученных для стероидных гормонов методами ХИА и РИА, достаточно высоки (л= = 0,94—0,98). Точность и воспроизводимость результатов иммуноанализа в существенной мере определяются конечной стадией регистрации излучения и сильно зависят от формы детектируемого сигнала.
• Таким образом-, использование производных изолюминола в качестве меток имеет ряд преимуществ: простота получения меченых соединений, высокое отношение полезного сигнала к фоновому, высокая точность и воспроизводимость результатов измерения.
Использование в качестве маркера в ХИА акридиновых эфиров. Одшм из перспективных направлений ХИА является применение в качестве маркеров антигенов и антител эфиров акридина, в том чиске с производными фенола. В процессе окисления перекисью водорода происходит разрыв сложной эфирной связи и образование соединения III, дальнейшее превращение которого приводит к возникновению электронно-возбужденного N-метилакри-дина (соединение IV):
(О (И)
(IV) (III)
• Преимущество данного механизма окисления состоит в том, что переход в электронно-возбужденное состояние и лзлучение света происходит после разрыва эфирной связи, вследствие чего исключается влияние молекулы антигена или антитела на хеми-люминесцентную реакцию и достигается высокая чувствительность определения маркера (10-17—10-18 моль в образце).
Предыдущая << 1 .. 51 52 53 54 55 56 < 57 > 58 59 60 61 62 63 .. 123 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed