Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
чаются стабильностью и могут быть использованы для разработки как гетерогенных, так и гомогенных методов ИФА.
Нижний уровень детекции производных- изолюминола составляет 1—5 пмоль. Как правило, производные изолюминола, конъюгированные с антигенами и антителами, имеют более низкий квантовый выход, что приводит к снижению чувствительности детекции. Люминол, изолюминол, производные люминола и изолюминола используются в качестве маркеров широкого круга соединений: белков, белковых ~и стероидных гормонов, лекарственных соединений и др.
# Почти все методы иммобилизации хемилюминесцентных меток включают следующие три основные стадии: 1) химическую активацию хемилюминесцентного маркера; 2) химическую модификацию белка или гаптена; 3) ковалентное связывание с помощью бифункционального реагента.
Общая структура обычно используемых хемилюминесцентных конъюгатов со стероидами и белками имеет вид
Известно большое количество методов для получения конъюгатов с л)оминолом. Часть методов вк'лючает стадию образования активных альдегидных групп при окислении углеводных остатков и гаптенов перйодатом натрия. Активные альдегидные группы на молекуле белка реагируют с ароматической аминогруппой с образованием основания Шиффа. Для ковалентного связывания люминола с модифицированными белками и гаптенами используют также глутаровый альдегид и карбодимиды.
Квантовый выход хемилюминесценции люмииола, связанного с белковой глобулой в реакции окисления перекисью водорода, катализируемой гемином (pH 13,5), составляет 0,3%. Данные по использованию люмииола в качестве метки приведены в табл. 4.10.
Значительно более широкое применение в качестве маркеров получили производные изолюминола. Опнсаио использование конъюгатов с производным изолюминола—[Ы-аи1Ы«об«/гыл-(Ы-этнл)-
изолюминолом (ABEI)] для определения белков, ряда белковых гормонов — хорионического гонадотропина человека, лютеинизи-рующего гормона, фоллйкулстимулирующего гормона и пролакти-на. Определение ведется с помощью методов иммуноанализа, основанных на применении: 1) меченых антигенов в конкурентном анализе; 2) меченых вторых антител ^универсальный реагент в конкурентном варианте); 3) меченых первых антител («сэндвичи-модификация).
Таблица 4.10. Использование конъюгатов на основе люминола в хемилюминесцентном иммуноанализе
Определяемое Предел Конъюгат/люмннесцентная '
соединение обнаружения, Система
Тестостерон ю-9 Люминол-Аг/Си-ацетат/Н202
IgG кролика 5-10-9 Люминол-Ат/КаОО/НгОг
IgG человека 5-10-8 Л юминол-Аг/гемии/НгОг
Дигоксин 8-10-11 Л юм нио л-Аг/гемогло бин/Н202
Инсулин 2-10-9 Люмииол-Аг/№ОС1/Н2С)2
Тироксин 7-10-9 Диазолюмииол-Ат/МПХ/Н202 *
Тироксинсвязывающий гло- ю-6 Диазолюминол-Аг/МПХ/Н202
гк\т ттттч
Uyjlnti ю-7 Диазолюминол-Ат/МПХ/Н202
Ферритин
С-реактивиый белок ю-6 Диазолюминол-Ат/МПХ/НгОз
• МПХ — мнкропероксидаза.
Конкурентный иммуноанализ применен для количественного определения хорионического гонадотропина человека в сыворотке крови и моче и лютеинизирующего гормона в моче. Описан «сэнд-вич»-метод для определения антител к иммуноглобулину человека. В качестве твердой фазы использовали 96-луночные микропланшеты из поливинилхлорида, регистрация результатов реакции осуществлялась автоматически.
• Преимущества метода — сокращение времени регистрации (до 5 с) по сравнению со спектрофотометрическим вариантом ИФА, высокая чувствительность—1 нг/мл. Производные изолюминола ковалентно связываются с бел ком с помощью, бифункциональных реагентов (водорастворимых) и водонерастворимых карбодиими-дов. Очень часто химически модифицируют с получением активированного эфира ABEI, который затем ковалентно связывается с молекулой белка.
ABEI как маркер потенциально обладает рядом преимуществ, позволяющих на основе этого маркера разрабатывать высокочувствительные методы иммуноанализа. Данные по использованию изолюминола как маркера приведены в табл. 4.11.
Большинство модификаций хемилюминесцентного анализа относятся к твердофазным методам иммуноанализа. Для разделения
прореагировавшего и непрореагировавшего конъюгатов используют полиСтирольные микропланшеты и пробирки, полиакриламидные шарики, нитроделлюлозные мембраны, гельфильтрадию на сефадексе G-25 и т. д.
В литературе описан также гомогенный вариант ХИА с использованием конъюгатов биотин — изолюминол. При взаимодействии этого конъюгата с авидином в двух окислительных систе-
Таблица 4.11. Использование производных изолюминола в хемилюминесцентном иммуноанализе
Определяемое Предел Конъюгат/люминесцентная
соединение обнаруже система
