Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
в диапазоне 10~5—10-3 М и предельное значение скорости реакции при концентрации выше 10~3 М. Использование концентраций перекиси, значительно превышающих насыщенную, не представляется целесообразным, так как в этом случае происходит возрастание фонового сигнала и, кроме того, увеличивается время, затрачиваемое на достижение максимальной интенсивности.
Зависимость скорости реакций от концентрации я-йодфенола и люциферина также имеет вид кривых с насыщением. Насыщающие концентрации составляют 5,0-10-5 М в случае я-йодфенола и 6,0-10-5 М в случае люциферина. В системе индивидуального окисления люминола при слабощелочных условиях нижняя граница определения пероксидазы равна 10-10 М. Добавление люциферина (или я-йодфенола) позволяет снизить предел детекции фермента на два порядка.
• Таким образом, реакция окисления люминола перекисью водорода в присутствии второго субстрата позволяет определять фермент в очень низких концентрациях 10-12—5-10~13 М. Такая же чувствительность достигается и в спектрофотометрических методах анализа, но в случае спектрофотометрической детекции необходима инкубация субстрата с ферментом в течение довольно длительного времени (около 30 мин). Кроме того, отношение сигнала к фону на всем диапазоне калибровочной кривой равно 20—60, в то время как для спектрофотометрических методов оно не превышает 3—5. Это преимущество системы двухсубстратного окисления является основным, обеспечивающим эффективность ее использования в иммуноанализе. Не менее важное достоинство реакции двухсубстратного окисления — длительный диапазон стационарной скорости реакции (постоянство интенсивности излучения в течение 20—30 мин).
Кинетика светового излучения определяется главным образом чистотой используемых реагентов, т. е. зависит от наличия в препарате люминола примесей аминофталата. Предложены методики очистки, позволяющие получать препарат люминола с практически постоянным излучением в течение 20—30 мин. Значение этого факта для иммуноанализа трудно преувеличить. Постоянство сигнала во времени обеспечивает высокую точность, улучшает воспроизводимость результатов, значительно снижает требования к сопряжению действия дозирующих устройств и измерительной аппаратуры при работе в автоматическом режиме. В этом варианте метод ЛИФА (пероксидаза как маркер) является полностью альтернативным методу РИА.
На основе реакции двухсубстратного (люминол и люциферин) пероксидазного окисления разработаны твердофазные иммуиомет-рические методы для определения антител к вирусу краснухи человека и конкурентный метод определения дигоксина. Чувствительность этих анализов была сопоставима с соответствующими вариантами фотометрических методов ИФА. Твердофазный метод
для определения иммуноглобулина Е человека имеет нижний предел детекции в этой" системе 2,6 IU/мл (для фотометрического варианта 3,6 IU/мл) и коэффициент вариации —3,9—13% (табл. 4.9).
В настоящее время реакция двухсубстратного пероксидазного окисления использована во многих вариантах твердофазного ИФА с применением различных носителей и фотодетекторов (фотоумножителей, кремниевых фотодиодов). Показано, что удовлетворительные результаты могут быть получены с применением очень
Таблица 4.9. ИФА на основе реакции усиленной хемилюминесценции пероксидазного окислении люминола Н202 в присутствии второго субстрата
Определяемое Конъюгат Второй Предел
соединение субстрат обнаружения
(усилитель)
Антитела к вирусу краснухи Ат-ПХ * Люцнфернн
IgE Ат-ПХ » 10 IU/мд
л-Йодфенол 10 IU/мл
Днгокснн Аг-ПХ Люцнфернн 0,5 нг/мл
Аг-ПХ л-Йодфенол 0,3 нг/мл
Раковоэмбрнональный анти Ат-ПХ » 3 нг/мл
ген
Хорноинческнй гонадотропин Ат-ПХ » 5 IU/мл
Фактор VIII Ат-ПХ » 0,2 IU/мл
• ПХ — пероксндаза.
простых устройств, позволяющих регистрировать световое излу-чение на фотопленках. Большое внимание уделено изучению геометрии носителей, обеспечивающих удовлетворительную регистрацию светового излучения по конечной точке. На основе твердофазного ИФА на нитроцеллюлозных дисках разработан быстрый метод обнаружения антител с регистрационной системой на по-ляроидной пленке. Метод применяется для определения антител к малярии, цитомегаловирусу. Продолжительность определения около 30 мин.
Таким образом, имеющиеся в настоящее время данные позволяют считать, что хемилюминесцентная система, основанная на совместном окислении люминола и второго усиливающего субстрата перекисью водорода, может рассматриваться как Одна из наиболее перспективных систем детекции взаимодействия антиген — антитело.
Хемйлюминесцентнын иммуносубстратный анализ. Другим направлением в ХИА является использование в качестве маркеров субстратов хемилюминесцентных реакций — аминофталгидразидов (АФГ). Эти соединения детектируются на уровне Пикомолей в течение очень небольших промежутков времени (0,3—2 с), отлн-
