Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Сравнительное изучение катали тических свойств пероксидазы и гемина показало, что гемин является более эффективным катализатором, чем пероксидаза, и его каталитическая активность возрастает в. щелочных условиях (pH 11—12). Вследствие этого наиболее высокие значения интенсивности хемилюминесценции в случае катализатора ПХ также наблюдаются при значениях pH 12— 13, так как в этих условиях осуществляется диссоциация пероксидазы на гемин и апофермент. Однако при этом наблюдается достаточно сильное фоновое окисление люминола, катализируемое
ионами металлов. Максимальная разница между значениями сигнала и фона достигается в растворах pH 11—12. Для достижения высокой чувствительности определения фермента необходим строгий контроль чистоты используемых реагентов. Предел обнаружения пероксидазы в оптимальных условиях составляет 10-12 М.
В слабощелочной среде уровень фоновых реакций значительно ниже, однако значительно ниже каталитическая активность фермента.
Точность и воспроизводимость ХИФА существенно определяется степенью диссоциации пероксидазы на гемин и апофермент, т. е. важным фактором, повышения чувствительности и точности метода является выбор условий для полной диссоциации ПХ на гемин и апофермент. Даже в сильнощелочных растворах процесс диссоциации осуществляется в течение 5—10 мин. Возможно использование додецилсульфата натрия, разрушающего белковую глобулу фермента, вследствие чего скорость диссоциации фермента увеличивается в 3 раза и улучшается воспроизводимость результатов. Этот подход был применен для определения тироксина и вируса X картофеля.
Еще одно направление развития люминесцентного анализа связано с использованием в качестве маркеров непосредственно самого гемина, родственных ему соединений и металлофталоциани-нов.
Достоинством гемина и других металлопорфиринов является их высокая стабильность по сравнению с ферментами. Надо отметить, что структурные особенности маркеров этого класса (высокая гидрофобность) создают определенные трудности при получении их конъюгатов с веществами небелковой природы — гормонами, лекарственными соединениями. Критерием возможности использования таких конъюгатов в анализе является сохранение антигенных свойств определяемого соединения, что удается достичь не во всех случаях.
Сравнительно недавно Кришка с соавторами (1983) опубликовали данные об открытии новой хемилюминесцентной реакции совместного окисления люминола и люциферина перекисью водорода, катализируемого пероксидазой. В этой системе обнаружен эффект усиления интенсивности хемилюминесценции в слабощелочных растворах (pH около 8,0). Незначительный уровень, фонового свечения в этих условиях и высокая интенсивность полезного сигнала позволяют детектировать в данной реакции до 5-10_1в молей пероксидазы. Изучение влияния ряда производных бензо-тиазола на интенсивность хемилюминесценции люмрнольной реакции пероксидазного окисления показало, что некоторые нз них также реагируют как усилитель (табл. 4.8). Наибольшее практическое использование нашел эффект усиления в присутствии я-йодфенола. Применение в качестве второго субстрата га-йодфе-нола представляет большой практический интерес, связанный с
тем, что выше рассмотренные усилители (люциферин и родственные ему соединения) синтезируются по сложным методикам и их стоимость высока.
Таблица 4.8. Влияние производных бензотиазола на интенсивность хемилюминесценции в реакции пероксидазного окисления люминола Н202 (Thorpe Q. Н. Q. et al, 1985)
Соединение R r2 Интеисявиость Усиление
хемилюмииес-
цеиции, мВ
1 Время, с
30 60 30 60
Производное бензотиазола H H 10 8 -
Л1, H OH 5950 7340 372 667
jOub H 0CH3 13 10 - -
nh2 OH 8 8 - -
nh2 OCH3 ' 9 6 - -
OH OH ¦ 5 5 - -
Cl OH 600 750 38 68
с Cl OCHj . 3 2 453 636
Ns--- /СООН OH* 7240 6990
<N] /СООН OH** 2480 2460 155 224
Ns---
<] >COOH OCH2CH3 5 4 ---
s---
* синтетический люцнфернн ** светлячковый люцифернн
Оптимизация условий проведения двухсубстратных реакций показала, что скорость реакции линейно зависит от концентрации люминола в диапазоне 10_6—-10-5 М и достигает предельного значения при концентрации порядка 5,9-10-5 М. Для перекиси водорода область линейной зависимости от концентрации наблюдается
