Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
В литературе описано использование в иммуноанализе реакций окисления аминофталгидразидов (АФГ) в присутствии катализаторов, реакций перекисного окисления эфиров акридина, пероксидаз-ного окисления пирогаллола (ПР) и других полифенолов:
АФГ °кислн1:ель- ^ аминофталат + hX (X = 425 нм)
катализатор
эфиры акридина ff«P« метилакридон + hX (^ = 470 нм)
ПР окислител--—» продукты + hv (X — 480 нм)
катализатор
Квантовые выходы в хемилюминесцентных реакциях ниже, чем в биолюминесцентных, однако чувствительность определения веществ (субстратов и катализаторов) сравнима с биолюминесцент-ными системами, что обусловливается, прежде всего, наличием специфических для каждого метода фоновых реакций, накладывающих ограничения на его чувствительность.
Наиболее широко используемой в иммуноанализе хемилюми-несцентной реакцией является реакция окисления АФГ. При окислении АФГ образуется ион аминофталата, который при переходе в основное состояние излучает свет (Ашах=425 нм). Реакция окисления АФГ протекает как в органической, так и в водной среде. Для протекания реакции в органических растворителях (диметил-сульфоксиде, диметилформамиде) необходимы только основание и кислород, в то время как в водной среде окисление АФГ происходит в присутствии окислителя и катализатора.
Особенно большой интерес в последнее время вызывают реакции пероксидазного окисления люминола. Помимо пероксидазы (ПХ) в качестве катализатора может выступать фрагмент цито-хрома С — гемин с 11 аминокислотными остатками, получивший название микропероксидазы (МПХ).
В литературе описано большое количество модификаций иммуноанализа с маркерами, детектируемыми в хемилюминесцентных реакциях. Классификация их, как правило, осуществляется в соответствии с типом метки. Маркером в методах хемилюминес-центного иммуноферментного анализа (ХИФА) является катализатор-фермент, в методах хемилюминесцеИтного иммуносубстрат-ного анализа (ХИСА) — молекулы субстратов.
Хемилюминесцентные методы иммуноферментного анализа. Использование катализаторов в качестве маркеров в люминесцентном иммуноанализе является наиболее перспективным направлением, поскольку относительно катализатора реакции квантовый выход гораздо выше, чем относительцо субстрата, и, следовательно, этот подход принципиально позволяет повысить чувствительность метода.
В' последнее время изучен ряд хемилюминесцентных реакций, имеющих достаточно низкое фоновое свечение, что позволяет использовать их для разработки простых и практически удобных модификаций ИФА, с помощью которых осуществляют регистрацию, основанную на накоплении хемилюминесцентного сигнала. Первые работы по ХИФА базировались на применении конъюгатов с гсероксидазой, детекцию которой осуществляди в реакциях окисления люминола или пирогаллола.
• Интерес к изучению этого фермента в качестве маркера в ХИФА можно объяснить: 1) доступностью фермента в очищенном виде; 2) относительной простотой методов получения конъюгатов пероксидазы с антителами и антигенами различной структуры;
3) высокой чувствительностью детекции пероксидазы в хемилю-минесдентных реакциях окисления АФГ (10-12 М).
Данные по применению пероксидазы в качестве маркера и детектирующей системы, основанной на реакциях окисления люми-нола и пирогаллола, представлены в табл. 4.7.
Реакция окисления пирогаллола проводится при близких к нейтральным значениях pH (pH 6,5), квантовый выход реакции составляет 10-5—10~6%. Чувствительность определения фермента этим методом составляет около 10~9 М. Исследования по люминесцентному ИФА, основанные на реакции окисления люминола, можно разделить на две основные группы: 1) определение фермента проводится в слабощелочной среде; 2) реакция окисления люминола Н2О2 проводится в щелочных условиях (pH 12—13).
Таблица 4.7. Хемилюмииесцентный иммуноферментный метод на основе реакции окисления люминола Н202
Определяемое
соединение
Предел обнаружения, М
Конъюгат/люминесцентная
система
Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) Анти-ЧСА-антитела IgG кролика
Иммуноглобулины лимфоцитов Кортизол
Антиген бактериальных клеток
Бактериальный энтеротоксин Вирусные антигены
5-10-9
10-9
5-10-9
МО-”
10-9
ПХ * — Ат/люминол/перборат
ПХ — Ат/алюминол/перборат Протогемин —Ат/люминол/перборат ПХ-Ат/люмииол/Н202
ПХ — Аг/люмииол/Н202 ПХ — Ат/пирогаллол/Н202
ПХ —¦ Аг/пирогаллол/Н2Ог ПХ/Ат/пирогаллол/Н202
* ПХ — пероксидаза.
Важным вопросом является выбор оптимальных условий реакции окисления люминола Н2О2 в присутствии пероксидазы, обеспечивающих высокую чувствительность определения фермента.
