Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика иммуноферментного анализа" -> 52

Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилов Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaipraktika1999.djvu
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 123 >> Следующая

О
(активная форма) * || (неактивная форма)
люцифераза — SH-J-CH3— S—S—(СН2)„ — антиген ->¦люцифераза —
О
-S — S —(СН2)Я— антиген восстанавливающий
(активная форма)
люцифераза-
¦SH
Модифицированный метилалкантиосульфонатом антиген инактивирует люциферазу, связываясь с цистеиновым остатком (Cys 106 а-субъединицы) активного центра. На определенной стадии иммуноанализа, требующей количественного определения маркера, S — S-связь между модифицированным антигеном и активным центром фермента восстанавливается действием тиоловых * агентов, при этом реактивированный фермент выходит в раствор, где его активность легко измеряется.
Заслуживает внимания еще один подход, когда в качестве маркеров антигена или антитела используют ферменты, катализирующие реакции с образованием АТР и NAD. Использование биолю-минесцентных систем для регистрации генерируемого в процессе реакции кофактора значительно повышает чувствительность определения фермента-маркера и, следовательно, чувствительность соответствующего метода анализа. Общая схема детектирующей системы может быть представлена следующим образом:
АТР, NAD-генерирующие субстрат АТР, NAD-завнсимые
биолюминесцентные
ферменты системы светляков
или бактерий
В научной литературе имеется описание исследований возможности использования в качестве маркеров фосфокиназ — ферментов, катализирующих реакции с образованием АТР.
Рассмотрено три типа ферментативных реакций. •
1. Пируваткиназы из мышц кролика:
фосфоенолпируват —” пируват + АТР
Реакция протекает в присутствии Mg2+ и К+, рН-оптимум 7,0.
2. Ацетаткицазы (из Е. coli):
ацетилфосфат + ADP ¦—*¦ ацетат + АТР
Для реакции необходим Mg2+ или Мп2+, рН-оптимум 7,4.
3. Аденилаткиназы (из мышц кролика):
ADP—> АТР + АМР
Реакция протекает в присутствии Mg2+, рН-оптимум 6,7.
Исследования показали, что конъюгаты на основе ацетаткина-зы и аденилаткиназы практически полностью утрачивают ферментативную активность, в то время как пируваткиназа, ковалентно связанная с антителами, сохраняет каталитические свойства. .
В качестве метки достаточно широко применяют глюкозо-6-фос-фатдегидрогеназу, катализирующую реакцию с образованием восстановленной формы кофактора — NADH. Использование для детекции NADH биолюминесцентной системы бактерий позволяет повысить предел обнаружения гаптена до 10~14 М. Описаны и более сложные полиферментные системы с многоступенчатой системой усиления сигнала (продукт первой реакции является субстратом для второй, продукт второй реакции — субстратом для третьей и т. д.). Примером такой системы может служить полиферментная система на основе галактозодегидрогеназы, р-галактозидазы и систем бактериальной люминесценции. Оптимизация условий протекания ферментативных реакций на каждой из стадий позволяет достигать значительного усиления сигнала.
Теоретически рассчитанная чувствительность такого метода очень высока, но практически всегда приходится сталкиваться с одновременным усилением не только полезного сигнала, но и фонового, обусловленного как химическим, так и иммунологическим шумом. Примеси кофакторов, дегидрогеназ в реагентах и образце, неспецифическое связывание конъюгата Являются причиной достаточно высоких сигналов, часто нивелирующих преимущества систем с многократным усилением. В этом плане очень интересен вариант «туннельного» ЛИФА, когда антитела к определяемому соединению соиммобилизованы на носителе с FMN-оксидоредуктазой и бактериальной люциферазой. Маркером антигена в этом способе является глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, генерирующая NADH, который при связывании антигена с антителами прямо используется FMN-оксидоредуктазной системой фермента бактериальной люминесценции. NADH, выходящий в раствор, быстро окисляется без излучения света. Различие в скоростях реакций в растворе и на носителе позволило значительно снизить интерферирующее влияние дегидрогеназ сыворотки крови и проводить определение в 25 мкл плазмы. Метод использован для определения прогестерона, а-фетопротеина, хорионического гонадотропина человека и пролактина.
Несмотря на то что методы БИФА пока не нашли еще широкого практического распространения, они обладают рядом преимуществ, что говорит о перспективности их разработок.
• К основным преимуществам этих методов следует отнести высокую чувствительность и возможность разработки высокочувствительных гомогенных методов экспресс-анализа.
Благодаря последним достижениям в области изучения структуры и функции ферментов, значительно снижены ограничения, обусловленные труднодоступностью и нестабильностью люцифераз. Получены препараты иммобилизованных биолюминеоцентных систем, которые могут быть использованы в иммуноанализе, базирующемся на реакциях светляковой и бактериальной люцифераз.
Хемилюминесцентный иммуноанализ. Хемилюминесцентные реакции, подобно реакциям биолюминесценции, обладают высокой чувствительностью определения веществ, участвующих в- реакции, что и обусловливает возможность их применения в качестве маркеров при разработке высокочувствительных методов иммуиоана-лиза.
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 123 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed