Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
+ Э3-16а-Г —AENADH
Концентрацию конъюгата определяли с помощью люциферазы бактерий. Однако использование этого метода для установления Э3-16а-Г в моче встретило ряд ограничений, связанных, прежде всего, с влиянием других компонентов мочи на биолюминесцентную систему. Включение в схему анализа стадии взаимодействия с иммобилизованными антителами с последующей отмывкой комплекса антиген — антитело от несвязавшихся компонентов образца и введение агентов, расщепляющих комплекс антиген — антитело для перевода восстановленного кофактора в раствор, существенно улучшили чувствительность метода.
• Недостатки гомогенного метода ЛИКА — это недостатки, присущие любому гомогенному варианту иммуноанализа. К ним следует прежде всего отнести влияние на результат анализа эндогенных примесей в образце и в самих реагентах. Использование АТР и NAD в качестве маркера требует удаления примесей этих кофакторов из препаратов антител (иммунных сывороток) и из образца. Для удаления АТР может быть использована обработка образца биологической жидкости раствором NaIO.t в течение 10—15 мин,
что является достаточным для модификации АТР таким образом, что кофактор теряет субстратную специфичность к светляковой люциферазе. Гетерогенные методы ЛИКА позволяют пренебречь влиянием эндогенного АТР на определение интенсивности излучения.
При использовании систем на основе бактериальной люцифера-зы необходимо принимать во внимание ее многокомпонентность. Условия проведения эксперимента должны быть выбраны таким образом, чтобы примеси дегидрогеназ, оксидоредуктаз, имеющиеся в образцах и реагентах, не оказывали влияния на детектирующую систему, не нарушили концентрационных соотношений в сложной полиферментной системе бактериальной биолюминесценции.
В последнее время предложен очень интересный подход, позволяющий обойти недостатки, связанные с многокомпонентностью систем. Суть его состоит в том, что полиферментная система, используемая в качестве детектирующей, соиммобилизуется на одном носителе, вследствие чего скорость реакции в такой системе существенно возрастает по сравнению со скоростью этой же реакции в растворе. Этот эффект объясняется повышением концентрации реагирующих соединений на носителе и уменьшением диффузионных затруднений, которые важны при проведении реакции в растворе и значительно снижаются при соиммобилизации всей ферментативной системы на носителе. Предложенный подход позволяет значительно повысить эффективность работы детектирующей системы по сравнению с полиферментной системой, присутствующей в образце (растворе). Такой вариант метода получил название «туннельного». Вклад химического «шума», -Вносимого образцом, в таком случае пренебрежимо мал.
Использование метода ЛИКА на основе светляковой люцифе-рйзы в существенной мере ограничено труднодоступностью самого препарата фермента. В этой связи большой интерес представляют исследования по генной инженерии люциферазы светляков. Разработка и внедрение новой технологии получения препарата люциферазы с субстратной специфичностью к‘АТР обеспечит возможность широкого практического использования этой высокочувствительной гомогенной модификации иммуноанализа.
Биолюминесцентный иммуноферментный анализ (БИФА). В этой группе методов можно выделить методы, основанные на использовании в качестве меток люцифераз (светляков и бактерий) и методы с маркерами — ферментами, участвующими в реакциях, сопряженных с люминесцентными системами. В табл. 4.6 приведены имеющиеся модификации БИФА ряда антигенов.
Несмотря на высокую чувствительность, достигаемую в БИФА, существуют трудности синтеза конъюгатов, связанные с инактивацией фермента. Процесс синтеза требует пристального внимания к деталям эксперимента, защиты активного центра фермента в процессе его ковалентного связывания с антигеном, что существенно
ограничивает использование люцифераз в качестве маркеров. В этой связи большой интерес представляет подход, основанный на возможности обратимой инактивации фермента, достигаемой модификацией существенного «особого» аминокислотного остатка активного центра фермента. Для осуществления обратимой инак-
Таблица 4.6. Биолюминесцентные иммуноферментные методы анализа
Определяемое
соединение
Конъюгат
Источник
люциферазы
Предел обнаружения в образце
2.4-ДНФ-лей-цин тринитротолуол (ТНТ)
2.4-ДНФ-лей-цнн
Метотрексат
Инсулин
Эстриол
Тироксин
2.4-ДНФТНТ/люцнфераза светляков
2.4-ДНФТНТ/глюкозо-6-фос-фатдегидрогеназа
2.4-ДНФ/люцифераза светляков
2.4-ДНФ/люцифераза бактерий
Метотрексат/люцифераза светляков Метотрексат/люцифераза бактерий
Инсулин/люцифераза бактерий
Эстриол/люцифераза бактерий
Тироксин/пнруваткиназа
Светляки 2,5 пмоль
1,0 пмоль
Бактерии 0,01 пмоль
Светляки 10 пмоль
Бактерии 15 пмоль
Светляки 2,5 пмоль
Бактерии 2,5 пмоль
<¦ » 0,5 пмоль
¦ » 50 пг
Светляки 10 пмоль
тивации люциферазы бактерий предложено использование метил-алкантиосульфонатов. Схема анализа в общем виде может быть представлена следующим образом:
