Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Люминесцентный иммунокофакторный анализ (ЛИКА). В методе ЛИКА используют в качестве маркеров антигенов молекулы кофакторов (АТР и NAD). Первые публикации по. ЛИКА показали принципиальную возможность использования такого подхода для определения модельных антигенов — 2,4-динитрофениллизина (2,4-ДНФ-лизин) и биотина (табл. 4.5).
Метод основан на свойстве Конъюгатов гаптена (антигена) с кофакторами (АТР и NAD) сохранять антигенную активность по отношению к антителам и коферментативную в реакциях с люци-феразами (светляков и бактерий). Антитела к гаптену при взаимодействии с конъюгатом стерически блокируют его, делая недоступным для взаимодействия с активным центром люциферазы, вследствие чего комплекс гаптен — кофактор — антитело утрачивает коферментативную активность. Концентрация образовавшегося комплекса может быть определена по снижёнию интенсивности излучения. Введение в эту систему свободного гаптена приводит к сдвигу
равновесия,, высвобождению связанного конъюгата, восстановлению интенсивности излучения, которая пропорциональна концентрации свободного гаптена.
Описанный метод является гомогенным, поскольку не требует стадии разделения прореагировавшего и непрореагировавшего конъюгата.
Эффект стерического исключения кофактора наблюдается не только для низкомолекулярных гаптенов, но и для более сложных по структуре молекул, например белкового гормона инсулина.
# Гомогенный тип и простота метода ЛИКА позволяют использовать его для экспресс-анализа антител, оценки связывающей способности иммунных сывороток. Действительно, Степень ингибирования светового излучения конъюгата кофактор — антиген гомологичной иммунной сывороткой пропорциональна концентрации в ней антител и определяется их константой связывания. Анализируя ряд сывороток в одних и тех же разведениях, можно достаточно быстро оценить и сравнить их связывающую способность.
Установлено, что ковалентное связывание АТР с инсулином не изменяет его антигенных свойств, что, по-видимому, объясняется как небольшими размерами самого маркера, так и его удаленностью от молекулы антигена. Это обстоятельство обеспечило возможность использования ЛИКА для решения ряда проблем: сравнительного изучения физико-химических свойств растворимых и иммобилизованных антител, исследования физико-химических характеристик антител на разных стадиях иммунного ответа, изучения структуры иммунных комплексов при разных соотношениях концентраций компонентов реакции антиген — антитело. Большой интерес к использованию этого подхода объясняется возможностью проведения реакций в растворе без введения твердой фазы, высокой чувствительностью метода, позволяющего работать в области физиологических концентраций инсулина.
Наряду с гомогенным вариантом ЛИКА на основе конъюгатов АТР — антиген известны гетерогенные модификации. Описано применение ЛИКА для количественного определения тироксина и мио-глобина. Способ проведения анализа в этом случае включает стадии' взаимодействия конъюгата с иммобилизованными антителами и отмывки. Затем связь между антигеном и АТР гидролизуется слабой кислотой, молекула интактного АТР поступает в раствор, где ее определяют с помощью люциферазы светляков.
Системы детекции, использующие бактериальную люГгиферазу, основаны на применении конъюгатов производных NAD и гаптенов (антигенов) (табл. 4.5).
Биотин и 2,4-ДНФ связывали ковалентно с аминогруппой нико-тинамид-6 (2-аминоэтиламино) пуриндинуклеотида (AENAD) для получения ферментативно активных конъюгатов—биотин AENAD и 2,4-ДНФ — AENAD. После восстановления кофактора в реакции с этанолом, катализируемой алкогольдегидрогеназой:
2,4-ДНФ — AENAD + этанол алкогольдегидрогеназа ? 2,4 =
=ДНФ — AENADH + адетальдегид
AENADH определяли в реакции с бактериальной люциферазой из Photobacterium fisheri. Интенсивность светового излучения биотин — AENAD и 2,4-ДНФ — AENAD ингибировалась специфическим связыванием с авидином и антителами к 2,4-ДНФ соответственно. Высокая чувствительность детекции кофактора в этой системе достигается благодаря использованию сопряженных ферментативных реакций, осуществляющих регенерацию NAD. Модифицированный NAD нашел использование в качестве метки при определении стероидов. Конъюгат для проведения анализа получали ковалентным связыванием активированного карбоксильного производного стероида с AENAD с последующей очисткой методом высоковольтного электрофореза. Коферментативная активность, определенная в реакции с люциферазой бактерий, составила 5—10 % от активности интактного кофактора. Антигенные свойства стероидов при взаимодействии с гомологичными антителами сохранялись.
Для определения эстриол-16 а-глюкоронида (Эз-16а-Г) разработан гомогенный биолюминесцентный метод, основанный на использовании конъюгата Эз-16 а-Г — NAD. Для восстановления метки применяли глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, катализирующую реакцию превращения глюкозо-6-фосфата в D-глюконо-б-лактон-б-фосфат:
D-глюкозо-б-фосфат + Эз-16а-Г —
— AF.NAP глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа’ ; 0-ГЛЮК030-б-ЛаКТ0Н-6-ф0СфаТ +
