Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
0,015. Оба типа реакций являются высокоэффективными каталитическими реакциями.
В аналитических работах измеряется либо значение пика световой интенсивности, либо интегральная характеристика свечения. При определенных условиях регистрируемая интенсивность свечения пропорциональна концентрации определяемого компонента реакции. Кроме того, люминесцентные реакции позволяют определять ряд соединений, участвующих в реакциях, сопряженных с люминесцентными системами.
• Преимуществом люминесцентных систем является возможность регистрации интенсивности излучения в широком диапазоне значений, что соответствует большому интервалу концентраций определяемых веществ. Регистрация излучения производится с помощью фотоумножителей, кремниевых фотодиодов, фотопленок, что делает простым и доступным аппаратурное оформление люминесцентных методов.
Все указанные достоинства люминесцентных систем позволили рассматривать их как эффективную систему детекции в иммуно-химическом анализе. Соединение люминесцентного анализа с методами йммуноферментного анализа обеспечило быстрое развитие нового направления — люминесцентного иммуноанализа (ЛИА).
Методы ЛИА используют в качестве маркеров антигена или антитела вещества, участвующие в люминесцентной реакции (субстраты, кофакторы, катализаторы и ферменты). Общая схема ЛИА включает специфическую реакцию взаимодействия антиген — антитело, один из компонентов которой (Аг или Ат) ковалентно связан с маркером, детектируемым в люминесцентной реакции:
Ат + Аг — Л -*¦ Ат • Аг — Л -> hv,
где Ат-—интитело; Аг — антиген; Л — люминесцентная метка.
Первые работы по люминесцентному иммуноанализу относятся к 70-м годам, когда была показана возможность использования люминесцентных маркеров для определения антигенов и антител.
К настоящему времени в литературе описано большое количество различных модификаций ЛИА, многие из которых нашли практическое использование.
Методы ЛИА можно разделить на две большие группы, биолю-минесцентные и хемилюминесцентные, отличающиеся по типу реакции, используемой в качестве Детектирующей системы.
Биолюминесцентный иммуиоанализ. Перспективными в плане использования в иммуноанализе являются биолюминесцентные реакции, катализируемые люциферазами светляков и бактерий:
АТР + люциферин + 02 л1°ЦиФеРаза светляков f ДДДр _]_
+ оксилюциферин +2РР/ + hv (560 нм)
NAD (Р)Н + Н+ + FMN оксиредуктаза , NAD (Р) + + FMNH2
FMNHg + Ог + RCHO людифераза бактерий ) _|_ RCOOH +
+ Н20 + hv (490 нм)
где RCHO и RCOOH — длинноцепочечный жирный альдегид и соответствующая кислота.
Важным свойством биолюминесцентных систем является их абсолютная специфичность по отношению к АТР (или NADH). Вы-\ сокий квантовый выход этих реакций обеспечивает высокую чувствительность детекции ферментов и кофакторов —0,1 пмоль для АТР и 1 пмоль для NADH, и обусловливает возможность использования люминесцентных систем в качестве систем детекции антиген-антительных взаимодействий.
Молекулы кофакторов и ферментов, участвующих в биолюминесцентных реакциях (либо в реакциях, сопряженных с ними), могут быть модифицированы и ковалентно связаны с молекулой
антигена или антитела. Поэтому признаку методы биолюминесцёит-ного иммуноанализа делятся на две группы — методы, использующие в качестве метки кофактор (люминесцентный иммунокофак-торный анализ, ЛИКА), и методы, основанные на ферментном маркере (люминесцентный иммуноферментный анализ, ЛИФА). -
Таблица 4.5. Люминесцентный иммунокофакторнын анализ
Меченое Маркер Определяемое Детектирующая Предел
соединение соединение система обнаружения
в пробе
Бнотин-2,4- Производное Бнотнн-2,4- СгНэОН/алко- _ ;
ДНФБ NAD ДНФ гольдегндрогена-
за -f- бактериаль
ная люцифераза
2,4-ДНФБ Производное (2,4-ДНФ)-Р- Люцнфернн, лю- 0,5 нмоль
АТР аланнн цнфераза светля 0,05 нмоль
ков
Инсулин Производное Инсулин То же 0,05 нмоль
АТР
Антитела к Производное Антитела к 0,05 нмоль
инсулину АТР инсулину
Тироксин Производное Тироксин . » ,1,0 нмоль
АТР
Многлобин Производное Многлобин 2,5 нмоль
АТР
Эстрнол-16- Производное Эстрнол-16- Глюкозо-6-фос- ---
глюкороннд NAD глюкороинд фатдегндрогеназа,
Прогестерон Производное Прогестерон
NAD
