Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Маттиассон с сотрудниками предложили новый путь разделения компонентов при проведении иммуноанализа, не сопровождающийся изменением агрегатного состояния системы. Суть метода
состоит в создании на стадии разделения связанного в иммунокомплексе и свободного компонента быстро расслаивающихся жидких двухфазных систем. При этом в одной фазе концентрируется несвязанный с антителами меченый антиген, а в другой — комплекс меченого антигена с антителами.
Количественной мерой в данном методе является коэффициент разделения компонентов, равный отношению концентраций меченого соединения в верхней и нижней фазах. В ряде случаев эффективность разделения может быть существенно увеличена при использовании связывающего агента (антитело, лектин, белок А стафилококка), предварительно модифицированного монометоксипо-лиэтиленгликолем. Метод может быть применен для анализа гаптенов, макромолекулярных антигенов и целых клеток.
• Достоинством является экспресскость и возможность определения различных по молекулярной массе и природе антигенов. Основной недостаток заключается в необходимости индивидуального выбора оптимальных условий разделения для каждой пары лиганд-связывающий агент и предварительной модификации компонентов для увеличения эффективности перераспределения веществ в раз* ных фазах.
В последние годы появился ряд гетерогенных методов ИФА, в которых не требуется проведения стадии разделения свободных и связанных в иммунохимический комплекс меченых соединений. Иногда в литературе такие подходы не вполне корректно относят к гомогенным методам, хотя все они основаны на использовании твердой фазы и иммобилизованных на ней компонентов. Правильнее их называть безразделительными методами (англ. non separation assay).
Рассмотрим один из подходов, получивших в зарубежной литературе сокращенное название ECIA (англ. enzyme channeling immunoassay), т. е. «туннельный» иммуноферментный анализ. Его принцип основан на ускорении протекания двух последовательных ферментативных реакций при пространственном сближении двух ферментов (Ei и Ё2). При этом Е2 катализирует реакцию с участием субстрата, являющегося продуктом первой ферментативной реакции. Определяемый антиген ковалентно связывают с ферментом Еь Этот конъюгат конкурирует за ограниченное число центров связывания антител, иммобилизованных на твердом носителе совместно со вторым ферментом Е2. Общая наблюдаемая скорость появления в растворе второго продукта Р2 зависит от концентрации свободного антигена в системе. При ее увеличении в растворе количество конъюгата, сорбированного на носителе, уменьшается, что приводит к уменьшению регистрируемой скорости появления продукта Р2. Для уменьшения фонового сигнала в растворе в отсутствие определяемого антигена в систему добавляют третий фермент Е3, который играет роль «ловушки» продукта Pi в растворе, превращая его в неактивный продукт Q:
На этом принципе основан биолюминесцентный ИФА прогестерона, позволяющий выявлять до 10 пг гормона в пробе.
• В заключение раздела еще раз подчеркнем, что основными достоинствами гетерогенных методов ИФА является высокая чувствительность, возможность определения соединений с различной молекулярной массой (от гаптенов до целых кЛеток), возможность анализа образцов, содержащих ингибиторы и активаторы фермента-маркера. Развивающиеся в настоящее время кинетические методы твердофазного ИФА, а также ИФА на основе водорастворимых полимеров открывают возможность «экспресса-анализа исследуемых веществ.
Оценивая состояние проблемы на сегодняшний день, следует отметить, что гетерогенные методы ИФА активно используются в иммунохимическом анализе, а появление новых, усовершенствованных модификаций свидетельствует о том, что интерес к этому направлению в ближайшие годы будет возрастать.
§ 7. Гомогенные методы ИФА
К гомогенным относятся методы ИФА, осуществляемые в однофазной системе и не требующие стадии механического разделения образовавшихся комплексов. Эти методы, в основном, базируются на эффекте модуляции антителами активности фермента (или кофактора), используемого в качестве метки.
Все известные в настоящее время схемы проведения гомогенного. ИФА относятся к типу II приведенной в начале гл. 4 классификации, т. е. во всех схемах регистрируется концентрация не образующегося специфического комплекса антитело — антиген, а оставшихся свободными центров специфического связывания. Однако, . в противоположность гетерогенным схемам, наблюдаемая ферментативная активность, соответствующая концентрации незанятых мест специфического связывания, может как уменьшаться, так и увеличиваться, что обусловлено различной природой воздействия связывания лигандов на ферментативную активность.
Так же как и в случае гетерогенных методов, разнообразие гомогенных вариантов анализа обусловлено возможностью введения метки как в молекулу антигена, так и в молекулу антитела. Кро-
ме того, по сравнению с гетерогенным ИФА гомогенный оперирует более широким кругом соединений, используемых в качестве метки. Кроме ферментов в нем применяют компоненты или эффекторы ферментативных реакций, такие, как кофакторы, ингибиторы, про-стетические группы, субстраты. Таким образом, схематическое разделение гомогенных методов может быть представлено следующим образом (схема 4.4):
