Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
После инкубации отмывают избыток конъюгата и углевода и добавляют фермент, имеющий углеводную часть, способную специфически взаимодействовать с лектином (например, пероксида-зу хрена, глюкозооксидазу из Aspergillus niger). На последней стадии определяется концентрация метки на твердой фазе, которая пропорциональна исходной концентрации исследуемых антител.
Необходимо отметить, что отсутствие углеводного компонента на молекуле фермента-метки не является непреодолимым препятствием для применения этого фермента в анализе на основе лектина. Так, авторами метода была показана возможность использования P-D-галактозидазы, у которой отсутствует углеводный компонент, предварительно ковалентно связанной через глутаровый альдегид с глюкозооксидазой, способной взаимодействовать с. лектином. Такой подход, конечно, приводит к усложнению анализа, но вместе с тем позволяет использовать ферменты, обладающие высокой каталитической активностью, что повышает чувствительность определения.
§ 5. Твердофазный ИФА в проточных системах
Решение ряда задач, стоящих перед медициной и биотехнологией, требует развития методов «экспресса-определения биологических соединений. В связи с этим актуальной проблемой является максимальное сокращение длительности анализа. В рассмотренных методах ИФА длительность всего анализа в основном определяется временем проведения одной или нескольких последовательных иммунохимических реакций. Известно, что максимальная чувствительность анализа достигается при проведении стадии взаимодействия определенного вещества с соответствующими специфическими центрами связывания в равновесном режиме. При переходе в кинетическую область время анализа существенно снижается, но при этом происходит и потеря чувствительности.
Однако при анализе соединений, находящихся в исследуемой пробе в концентрациях, значительно превышающих предел его обнаружения, длительность ИФА можно существенно уменьшить за счет проведения иммунологической и ферментативной реакций в кинетических режимах, сокращая время контакта компонентов с часов до нескольких минут.
Методически такой анализ наиболее удобно проводить в проточных реакторах, время контакта компонентов в которых регулируется скоростью потока. Одним из вариантов такого анализа является следующий. Через колонку с иммуносорбентом в течение 1 мин прокачивают смесь меченного ферментом и анализируемого антигенов, которые конкурируют за центры связывания иммобилизованных антител. Затем колонку промывают, пропускают субстрат и измеряют на выходе оптическую плотность продукта ферментативной реакции, которая пропорциональна ксжцентрации определяемого антигена:
Полный цикл определения составляет 10 мин. После удаления связавшегося свободного и меченого антигена действием pH, растворов солей или этанола колонка с иммуносорбентом может вновь использоваться для анализа.
. Необходимым условием для получения воспроизводимых результатов анализа в кинетическом режиме является постоянство таких параметров, как время контакта реагентов, температура, объем анализируемой пробы.
В этой связи весьма перспективно сочетание принципов ИФА и проточного инжекционного анализа. Один из возможных вариантов основан на применении анализа с вытеснением связанного в комплекс с иммобилизованным антителом меченного пероксидазой антигеца.
)— 1-0 >-©
f-O >-© >-©
o>-®
hO^
o>-®
y—. >-©
2) отмывка
|-o>-
ioy®
активности
Отличием такого подхода от уже рассмотренных схем является определение ферментативной активности не на носителе, а в растворе путем введения в соответствующий канал субстратов фермента и последующей регистрации продукта ферментативной реакции в проточной кювете спектрофотометра.
Ф Большинство методов ИФА основано на фотометрическом, флу-ориметрическом, люминесцентном или электрохимическом определении продукта ферментативной реакции. Обычно в равновесных анализах стадия регистрации ферментативной активности занимает относительно длительный промежуток времени (от 30 мин и более). При сокращении длительности ИФА за счет проведения реакции антиген — антитело в кинетическом режиме необходимо применять быстрые методы детекции ферментной метки, иначе время осуществления ферментативной реакции будет лимитировать время анализа в целом.
Обычно в таких случаях измеряют начальную скорость ферментативной реакции, что при применении современных анализаторов занимает 0,5—2 мин.
Другой путь проведения ИФА в проточных реакторах основан на регистрации теплового эффекта реакции фермент — субстрат с помощью термистера. Определяемый экспериментально тепловой эффект зависит от количества связанного с иммуносорбентом ферментного конъюгата, которое в свою очередь зависит от начальной концентрации исследуемого соединения. На примере человеческого сывороточного альбумина с использованием его конъюгата с ката-лазой показана возможность определения белка в концентрации 0,1 мМ в течение 10 мин.
