Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
• При сравнении конкурентных и неконкурентных методов можно отметить следующее. Во-первых, как вытекает из теоретического
анализа, конкурентные методы обладают меньшей чувствительностью по сравнению с неконкурентными. Предел обнаружения различных соединений для них ограничен как чувствительностью регистрации ферментной метки, так и аффинностью антител, в то время как для неконкурентных методов, при отсутствии неспецифических взаимодействий, — только чувствительностью определения фермента. Поэтому для достижения высокой чувствительности анализа конкурентным методом необходимо использовать высокоаффинные антитела, что не всегда достижимо на практике.
Вторым общим недостатком конкурентных методов ИФА является возможность влияния различных эффекторов, содержащихся в анализируемых биологических жидкостях (сыворотка крови, сок растения, экстракты тканей и т. д.), на каталитические свойства ферментной метки. Во многих случаях подобный эффект может быть устранен путем многократного разведения исходного образца. Однако возможность его разведения зависит от содержания исследуемого соединения, что должно быть учтено при выборе схемы ИФА.
При выборе твердофазных схем определения следует учитывать, что скорость достижения равновесия в системе иммобилизованный реагент — анализируемое соединение зависит не только от концентрации компонентов, но может снижаться за счет микро-диффузионных эффектов. На анализ в таких системах, как правило, затрачивается время не менее нескольких часов. Переход к гомогенно-гетерогенным методам, в которых реакция образования первичного специфического иммунокомплекса протекает в растворе, значительно снижает время достижения равновесия на первой стадии. При этом сокращается и время анализа в целом, так как для разделения компонентов используется избыток иммобилизованных вторичных антител. Осуществление стадии «узнавания» в гомогенной фазе повышает также и точность анализа, которая определяется точностью дозирования компонентов. В тех случаях, когда анализируемая среда содержит эндогенный фермент, кофактор или эффектор, твердофазные неконкурентные методы являются наиболее эффективными.
§ 4. Методы гетерогенного ИФА, основанные на нековалентном способе введения ферментной метки
Рассмотренные выше методы гетерогенного иммуноанализа основаны на использовании ковалентных конъюгатов фермента с антителами или антигенами. В настоящее время этот
путь является основным в ИФА. Однако в ряде случаев химическая модификация фермента невозможна без ухудшения его каталитических свойств, а антигена (антитела) —без снижения способности образовывать прочный иммунохимический комплекс. В связи с этим существенный интерес представляют методы ИФА, в которых ферментная метка вводится в процессе анализа нековалентно.
9 Можно выделить следующие наиболее эффективные подходы:
1) использование комплекса фермент—антитело против фермента; отин.
3) введение ферментной метки через комплекс авидин — биотин.
Введение ферментной метки через комплекс со специфическими антителами против фермента наиболее часто применяется при использовании в качестве метки пероксидазы хрена. Этот анализ встречается в литературе под названием ПАП-метода (ПАП—пе-роксидаза—антипероксидаза).
В качестве примера приведем схему определения кроличьих антител против какого-либо антигена ПАП-методом. К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую пробу. После инкубации и отмывки несвязавшихся компонентов к носителю добавляют анти-видовые антитела (например, сыворотку крови осла, иммунизированного IgG кролика). Проводят повторную инкубацию, отмывку и вводят в систему антитела кролика против пероксидазы. Смесь инкубируют, носитель отмывают и на последней стадии добавляют пероксидазу, образующую специфический комплекс с соответствующими антителами, который выявляют обычными методами. Одним из вариантов схемы является добавление на стадии 5) не антител против пероксидазы, а заранее приготовленного ПАП-комп-лекса. Схема метода:
5—
к>:
Я
5) инкубация я + ^ = |-0 .
l-oy* >- Ш
-о
) I -
+ >-
fo:
6) отмывка Я
to:
© + © ©
f-о:
7) инкубация ^ ^
.уЛ>-
§_0>А^
©
8) отмывка
Отметим, что ПАП-метод может быть формально отнесен к классифицированным ранее методам с использованием меченых антивидовых антител, только в данном случае используется не ковалентный конъюгат антивидовое антитело — фермент, а последовательно получаемый комплекс антивидовое антитело — антитело к пероксидазе — пероксидаза. Недостатком ПАП-метода* является удлинение схемы анализа, частичное ингибирование пероксидаз-ной активности при образовании комплекса с антителами, возможность диссоциации комплекса антитело—фермент при разведениях, промывках, изменениях pH и ионной силы среды.
Процедура анализа несколько упрощается по сравнению с ПАП-методом при использовании комплекса фермента с так называемыми гибридными антителами. Схема получения гибридных антител имеет вид
